Abstract

  • BBB, barieră hematoencefalică
  • DMOG, 1,2-dimiristoil-3-oleoil-rac-glicerol
  • DPOG, 1,2-dipalmitoiil-3-oleoil-rac-glicerol
  • DSOG, 1,2-distearoil-3-oleoil-rac-glicerol
  • FFA, acid gras liber
  • LR, soluția lactată Ringer
  • MBEC, celulă endotelială a creierului șoarecelui

Leptina este o proteină de 16 kDa secretată de celulele grase (1) care reglează hrănirea și cheltuielile de energie acționând în locuri în primul rând din sistemul nervos central (2-4). Obezitatea la om și la rozătoare este aproape întotdeauna asociată cu rezistența la leptină, mai degrabă decât cu o deficiență a acesteia (5-7). Rezistența este asociată cu afectarea funcțiilor de transport, receptor, postreceptor și circuitele neuronale din aval la modelele animale de obezitate (9-13). Leptina este transportată peste bariera hematoencefalică (BBB) ​​de un transportor saturabil (8), iar transportul afectat poate fi dobândit, poate preceda defectele receptorului/postreceptorului, se agravează odată cu creșterea obezității și este într-o oarecare măsură reversibil (14-) 16). Relația dintre lichidul cefalorahidian și nivelurile serice ale leptinei la oamenii obezi (17,18) sugerează că transportul BBB defect reprezintă mai mult din rezistența generală la leptină decât defectele receptorului/postreceptorului (19).

rezistența

Defectul legat de obezitate în transportul leptinei BBB are două aspecte (10). În primul rând, substanțele circulante provoacă o afectare imediată. Leptina însăși, care are un nivel crescut de obezitate, este probabil una dintre aceste substanțe circulante. În al doilea rând, un mecanism neidentificat afectează transportul la șoarecii obezi chiar și atunci când transportul BBB este evaluat prin perfuzie cerebrală, o metodă care elimină efectele imediate ale substanțelor transmise în sânge. Administrarea postului sau a leptinei poate inversa parțial aceste defecte în transportul leptinei (16).

Înfometarea, ca și obezitatea, este însoțită de o rată redusă de transport BBB a leptinei exogene (20). În timp ce este dificil de explicat avantajul evolutiv al scăderii transportului de leptină în obezitate, un avantaj este evident în foamete. Scăderea cantității de proteine ​​anorectice care ajunge la sistemul nervos central ar trebui să îmbunătățească impulsul pentru căutarea hranei. Mecanismul afectării înfometate în transport este necunoscut, dar nu poate fi cauzat de leptină însăși, deoarece nivelurile sale scad odată cu postul (21).

Aici, postulăm că trigliceridele pot sta la baza afectării transportului BBB atât în ​​obezitate, cât și în foamete. Trigliceridele scad odată cu postul, dar sunt crescute cu foamete și tind să fie crescute cu obezitate. Susținând această ipoteză este observația că șoarecii cu sinteză de trigliceride afectate sunt protejați împotriva dezvoltării atât a obezității induse de dietă, cât și a rezistenței la leptină indusă de obezitate (22). Astfel, hipertrigliceridemia ar putea explica afectarea transportului leptinei peste BBB atât în ​​foamete, cât și în obezitate.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Marcarea radioactivă a leptinei.

Leptina recombinantă a șoarecelui (un cadou de la Amgen, Thousand Oaks, CA) a fost marcată radioactiv cu 131 I (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) prin metoda lactoperoxidazei, iar I-Lep a fost purificat pe o coloană de G-10 Sephadex. Activitatea specifică a fost ∼100–125 Ci/g.

Măsurarea transportului leptinei pe BBB la șoareci.

Toate studiile au fost aprobate de comitetul local de îngrijire și utilizare a animalelor, au fost efectuate într-o asociație aprobată de Asociația pentru Evaluare și Acreditare a Laboratorului și au utilizat șoareci adulți CD-1 de sex masculin din colonia noastră. Șoarecii au fost anesteziați cu uretan (4,0 g/kg i.p.), iar vena jugulară stângă și artera carotidă dreaptă au fost expuse. Un total de 0,2 ml de soluție lactată Ringer (LR) cu 1% BSA conținând 10 6 cpm de I-Lep a fost injectat în vena jugulară. Sângele a fost colectat din artera carotidă și întregul creier a fost îndepărtat la 10 minute după injecția jugulară, moment în care radioactivitatea reprezintă I-Lep intact (8). Sângele a fost centrifugat la 5.000 g timp de 10 minute la 4 ° C și serul a fost colectat. Întregul creier a fost curățat de vase mari și cântărit după eliminarea glandei pituitare și pineale. Nivelurile de radioactivitate din creier și ser au fost măsurate într-un contor γ, iar raporturile creier/ser (μl/g) au fost calculate.

Studii de perfuzie a creierului șoarecilor.

Șoarecii au fost anesteziați cu uretan (4,0 g/kg i.p.). Toracele a fost deschis, inima a fost expusă, ambele jugulare au fost tăiate și aorta toracică descendentă a fost prinsă. Un ac de fluture de calibru 26 a fost introdus în ventriculul stâng al inimii și tamponul lui Zlokovic și colab. (23) conținând I-Lep [2 (10) 6 cpm/ml] a fost perfuzat la o rată de 2 ml/min timp de 5 min (24). Numărul exact pe minut perfuzat a fost determinat pe o alicotă de 10 μl de fluid de perfuzie. După perfuzie, spațiul vascular al creierului a fost spălat prin injectarea a 20 ml LR în 4 celule/inserție) cultivate la 70-80% confluență au fost adăugate la inserțiile de cultură Transwell (Coster, format cu 24 de godeuri, 3470) și cultivate pentru 3 mai multe zile. Transwells au avut un volum al plăcii de cultură (partea abluminală) de 0,6 ml, un volum al inserției de 0,1 ml și porii membranei de poliester de 0,4 μm. Rezistența electrică transendotelială a fost utilizată pentru a confirma confluența monostraturilor în ziua studiului. Lep a fost adăugat în camera luminală cu sau fără lapte 10%. Camera abluminală a fost prelevată la 1, 2,5 și 5 minute după adăugarea I-Lep. Procentul de material transportat pe minut (PMT/min) a fost calculat cu următoarele (30):

unde t este timpul în minute. „Cpm în camera abluminală” a fost corectat scăzând cpm care intrase în camera luminală și adăugând cpm-ul prezent în inserțiile MBEC la sfârșitul experimentului.

Măsurarea nivelurilor serice de leptină.

Radioimunotestul de leptină murină utilizat (Linco, St. Charles, MO) are o reactivitate încrucișată de 50% cu leptina de șobolan și nu are reactivitate încrucișată cu leptina umană sau bovină.

Administrarea de lapte și intralipid.

Un total de 2,5 ml de LR, lapte integral sau intralipid (Pharmacia & UpJohn, Peapack, NJ) au fost injectați intraperitoneal la șoareci CD-1. I-Lep (10 6 cpm în 0,2 ml LR) a fost injectat 0,5-24 ore mai târziu în vena jugulară dreaptă. Rapoartele creier/ser au fost calculate la 10 minute după injectarea intravenoasă de I-Lep așa cum s-a descris mai sus. La alți șoareci, absorbția cerebrală de I-Lep intravenos a fost măsurată la 4 ore după injectarea intraperitoneală de lapte fără grăsimi, lapte integral, intralipid sau LR. La alți șoareci, 0,2 ml lapte fără grăsimi, lapte integral, intralipid sau LR conținând 10 6 cpm de I-Lep a fost administrat intravenos cu 10 minute înainte de recoltarea creierului și a sângelui.

Prepararea emulsiilor de trigliceride și acizi grași liberi.

Trigliceridele sau acidul gras liber (FFA) și l-a-fosfatidilcolina (toate de la Sigma) au fost dizolvate fiecare în cloroform, amestecate și uscate sub un curent de azot gazos. S-a adăugat tamponul lui Zlokovic și materialul a fost amestecat viguros, omogenizat și alternativ înghețat în azot lichid și decongelat într-o baie de apă caldă timp de 12 cicluri. Materialul a fost fie imediat diluat până la concentrația dorită cu LR conținând I-Lep și injectat intravenos, fie depozitat la -20 ° C pentru utilizare în 48 de ore. Oleatul a fost cumpărat sub formă lichidă, uscat și utilizat imediat după dizolvare în cloroform. În ziua studiului, șoarecii anesteziați au primit injecții intravenoase de 0,2 ml LR conținând 1% BSA și 10 6 cpm I-Lep cu sau fără emulsie FFA sau trigliceridă. Sângele și creierul arterei carotide au fost obținute 10 minute mai târziu, iar rezultatele au fost exprimate ca raporturi creier/ser.

Administrarea gemfibrozilului.

Șoarecii au fost cântăriți și hrăniți 1 ml/kg ulei vegetal cu sau fără gemfibrozil (1 g/kg) de două ori pe zi timp de 5 zile. În dimineața următoare zilei ultimei doze, șoarecii au fost anesteziați și li s-a administrat intravenos I-Lep, iar sângele cerebral și arterial a fost colectat 10 minute mai târziu, așa cum s-a descris mai sus. Nivelurile de trigliceride au fost măsurate pe serul arterial cu un kit (Sigma).

Obezitate indusă de dietă.

Șoarecii au fost cântăriți și menținuți pe alimente obișnuite (4,5% grăsimi, 5001 Rodent Diet; PMI Nutrition International, Brentwood, MO) sau au fost trecuți la hrană de reproducție (10% grăsime, Teklad Mouse Breeder Diet; Harlan Teklad, Madison, WI) pentru o medie de 17 săptămâni. Probele de creier și sânge au fost colectate la 10 minute după I-Lep intravenos, așa cum s-a descris mai sus. Nivelurile de trigliceride au fost măsurate pe ser. Acest experiment a fost repetat, cu excepția faptului că fiecare grup dietetic a fost randomizat în grupuri de 16 ore post și non-post.

analize statistice.

Mijloacele sunt raportate cu erorile lor standard și n. Două grupuri au fost comparate printr-un test t. Peste două grupuri au fost comparate de ANOVA urmate de un test post-hoc Newman-Keuls. Liniile de regresie au fost calculate prin metoda celor mai mici pătrate, iar pantele lor au fost comparate cu pachetul software din Prism 4.0 (GraphPad, San Diego, CA).