• Ecran divizat
  • Pictogramă Partajare Acțiune
    • Facebook
    • Stare de nervozitate
    • LinkedIn
    • E-mail

  • Pictogramă Instrumente Instrumente

    • Yoshitaka Miyakawa, Atsushi Oda, Brian J. Druker, Katsutoshi Ozaki, Makoto Handa, Hideya Ohashi, Yasuo Ikeda; Trombopoietina și trombina induc fosforilarea tirozinei Vav în trombocitele de sânge uman. Blood 1997; 89 (8): 2789-2798. doi: https://doi.org/10.1182/blood.V89.8.2789

      induc

      Descărcați fișierul de citare:

      Abstract

      Accentul acestui raport este produsul proto-oncogen Vav, o proteină de 95 kD exprimată în principal în celulele hematopoietice. 10-20 Dacă Vav este esențial în hematopoieză este o problemă controversată. 17-20 Cu toate acestea, un raport recent sugerează că Vav poate fi indispensabil pentru eritropoieza la adulți. 21 Se știe că citokinele multiple și factorii de creștere hematopoietici induc fosforilarea tirozinei Vav. 10-16 În plus, mai multe rapoarte indică faptul că Vav are un rol major în semnalizarea prin receptorii de antigen ai celulelor T și B din celulele limfoide.22-24

      Având în vedere prezența receptorilor funcționali ai trombopoietinei pe trombocite și existența proteinelor de 95 până la 85 kD ca proteine ​​majore fosforilate de tirozină după stimularea trombocitelor cu trombopoietină2, am examinat dacă trombocitele pot avea proteină Vav și dacă devine tirozină fosforilată după tratamentul cu trombopoietina. Arătăm că trombopoietina induce o creștere a fosforilării tirozinei Vav în trombocite, fără o creștere a concentrației de calciu ionizat citosolic ([Ca 2+] i) sau activarea protein kinazei C. Trombina, U46619, colagen sau forbol 12-miristat 13 acetat (PMA), toate despre care se știe că activează protein kinaza C, 25 induc, de asemenea, o creștere a fosforilării tirozinei Vav. Trombina induce redistribuirea Vav în reziduul insolubil Triton X-100 într-un mod dependent de agregare. În cele din urmă, similar multor proteine ​​încorporate în reziduul insolubil Triton X-100 după agregarea trombocitelor, cum ar fi proteina integratoare β3, p60 c-src, talină și actină, am constatat că Vav este un substrat endogen pentru calpaină, sugerând că Vav poate avea un rol în evenimente postagregare.26-34

      MATERIALE ȘI METODE

      Prepararea trombocitelor. Sângele uman de la voluntari sănătoși a fost extras prin puncție venoasă în 1/10 volum de 3,8% (greutate/vol) citrat trisodic și amestecat ușor. Plasma bogată în trombocite (PRP) a fost preparată prin centrifugarea întregului sânge la 200g timp de 20 de minute și aspirarea PRP. PRP a fost incubat cu aspirină (2 mmol/L) timp de 30 de minute la temperatura camerei. S-a adăugat PGE1 (1 μmol/L) dintr-o soluție stoc în etanol absolut (1 mmol/L). PRP a fost filat la 800 g pentru a forma o peletă moale de trombocite. Peleta a fost resuspendată în 1 ml dintr-un tampon HEPES-Tyrode modificat (129 mmol/L NaCl, 8,9 mmol/L NaHCO3, 0,8 mmol/L KH2PO4, 0,8 mmol/L MgCl2, 5,6 mmol/L dextroză și 10 mmol/L HEPES, pH 7,4) conținând și pirază (2 U/ml) și spălat de două ori. Trombocitele au fost resuspendate în același tampon la o concentrație de 3 × 108 celule/ml cu pirază (2 U/ml) conținând 1 mmol/L CaCl2 la 37 ° C.

      Linii celulare. O linie celulară dependentă de trombopoietină (FDCP-hMpl5) a fost stabilită anterior prin transformarea celulelor FDCP-2 cu o plasmidă de expresie care conține cDNA c-mpl uman de lungime completă condusă de repetarea terminală lungă a virusului sarcomului Moloney murin. 3,37,38 Înainte de tratarea celulelor cu reactivi, acestea au fost incubate în IMDM conținând 10% ser fetal de vițel (FCS) fără interleukină exogenă (IL) -3 timp de 6 ore. După două spălări, au fost incubate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS; pH 7,4).

      Imunoprecipitare. Stimularea celulei a fost încheiată prin adăugarea unei cantități egale de tampon de liză (15 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L PMSF, 10 mmol/L EGTA, 1 mmol/L ortovanadat de sodiu, 0,8 μg/ml leupeptină, 2% Triton X-100 (V/W), pH 7,4). După 20 de minute pe gheață, lizatele au fost centrifugate la 10.000 g (la 4 ° C) timp de 20 de minute. Supernatantul a fost îndepărtat și incubat cu ser preimun și proteină A-Sepharose (40 μL de suspensie 50%) timp de 1 oră. Anticorpii policlonali sau monoclonali doriți au fost apoi adăugați și incubați timp de 2 până la 3 ore pe gheață. S-a adăugat agaroză conjugată IgG cu proteină A-Sepharose sau antimouse (40 μL de suspensie 50%) și incubată timp de câteva ore. Complexele imune au fost spălate cu 1 ml tampon de spălare la rece (15 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCI, 1 mmol/L PMSF, 10 mmol/L EGTA, 1 mmol/L ortovanadat de sodiu, 0,8 μg/ml leupeptină, 1% Triton X-100 [vol/greutate], pH 7,4) de trei ori și apoi resuspendat în tamponul de probă al lui Laemmli.

      Izolarea citoscheletului trombocitar definit operațional. Citoscheletul insolubil Triton X-100 a fost izolat așa cum s-a descris cu următoarea modificare. 36 Pe scurt, o cantitate egală de tampon de liză (15 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L PMSF, 10 mmol/L EGTA, 1 mmol/L ortovanadat de sodiu, 0,8 μg/mL leupeptină, 2% Triton X-100 [vol/greutate], pH 7,4) a fost adăugat la suspensiile de trombocite pentru a solubiliza trombocitele. După 5 minute pe gheață, lizatele au fost centrifugate la 10.000 g. Peleta rezultată a fost spălată de două ori în tampon de spălare (145 mmol/L NaCI, 0,1 mmol/L MgCl2, 0,5 mmol/L PMSF, 5 mmol/L EGTA, 1 mmol/L ortovanadat de sodiu, 0,4 μg/mL leupeptină, 1% [ vol./greutate] Triton-X 100, pH 7,4). Pentru electroforeza SDS unidimensională, reziduul insolubil Triton X-100 a fost solubilizat în tampon de probă SDS. Supernatantul a fost diluat cu un volum egal de tampon de probă SDS concentrat de două ori.

      Încărcarea trombocitelor cu 32 Pi și analiza proteinelor fosforilate. Detectarea fosforilării lanțului ușor de miozină și a pleckstrinei a fost efectuată așa cum a fost descris cu următoarele modificări. 40 Peletele moi de trombocite, preparate așa cum s-a descris mai sus, au fost resuspendate în tamponul HEPES-Tyrode modificat fără KH2PO4, dar cu pirază (2 U/ml) și incubate timp de 1 oră la temperatura camerei. Trombocitele spălate au fost preparate așa cum s-a descris mai sus. Trombocitul lizat a fost preparat și analizat pe 7,5% până la 15% SDS-PAGE. 39 Gelurile au fost uscate și autoradiografiate cu filme X-Omat (Eastman Kodak, Rochester, NY).

      REZULTATE

      Au fost utilizate antiseruri specifice împotriva Vav pentru a determina dacă Vav este prezent în trombocitele umane. Aceste antiseruri recunosc o bandă de 95 kD în lizatele din trombocitele umane care conigrează cu o bandă de 95 kD în lizatele din celulele Jurkat, care exprimă Vav, indicând faptul că trombocitele au Vav (datele nu sunt prezentate). 41-43 La fel ca în alte celule hematopoietice, am constatat că Vav este asociat în mod constitutiv cu Grb2, o proteină adaptoare SH2/SH3 (datele nu sunt prezentate) .11,44

      Am examinat dacă Vav devine tirozină fosforilată în trombocite tratate cu trombopoietină. Trombocitele tratate cu trombopoietină (100 ng/ml) de mai multe ori au fost lizate într-un tampon conținând 1% Triton X-100 și imunoprecipitate cu antiseruri Vav specifice. Aceeași cantitate de proteină de 95 kD recunoscută de antiserurile Vav a fost imunoprecipitată din toate lizatele celulare (Fig. 1A, panoul inferior). După tratamentul cu trombopoietină, aceeași proteină a fost din ce în ce mai tirozină fosforilată peste nivelul bazal scăzut (Fig. 1A, panoul superior). Astfel, trombocitele au Vav, care devine tirozină fosforilată după tratamentul cu trombopoietină al trombocitelor umane. Trombina (1 U/mL), colagenul (10 μg/mL) sau U46619 (1 μmol/L) și tromboxanul mimetic, induc, de asemenea, fosforilarea tirozinei Vav în trombocite (Fig. 1B și C). Trebuie remarcat faptul că adăugăm în mod obișnuit peptida RGDS (200 μg/ml) la suspensiile de trombocite și agitarea minimă în prezența agoniștilor pentru a diminua efectele legării fibrinogenului la α IIbβ3 și a agregării ulterioare, care influențează profund fosforilarea tirozinei proteinelor trombocitare.34, 45

      (A) Trombopoietina nu induce fosforilarea pleckstrinei sau a lanțului ușor de miozină. 32 de trombocite încărcate cu Pi au fost stimulate fie cu trombopoietină (100 ng/mL), fie cu trombină (1 U/mL). Lizatele de celule întregi au fost separate prin SDS-PAGE (gel de 7,5% până la 15%). Gelurile au fost uscate și autoradiografiate. Căile 1 și 6, trombocite în repaus; benzi 2 până la 5, 15 secunde, 1 minut, 5 minute, 10 minute după adăugarea trombopoietinei (100 ng/ml); benzi 7-9, 15 secunde, 1 minut, 2 minute după adăugarea de trombină (1 U/ml). Săgeata superioară indică poziția relativă a pleckstrinului; săgeata inferioară, lanț ușor miozină. (B) Efectele BAPTA-AM și Ro 31-8220 asupra fosforilării tirozinei a Vav indusă de trombină sau trombopoietină. Trombocitele au fost preincubate cu BAPTA-AM (40 μmol/L) și Ro-31-8220 (10 μmol/L) în prezența 1 mmol/L EGTA timp de 15 minute. După incubare, la suspensia de trombocite s-a adăugat trombină (1 U/mL, banda 2) sau trombopoietină (100 ng/mL, banda 3). După 10 minute, trombocitele au fost lizate prin adăugarea unei cantități egale dintr-un tampon conținând 2% Triton X-100. Fosforilarea cu tirozină a Vav a fost detectată ca în Fig 1 (panoul superior). Aceeași membrană PVDF utilizată în panoul superior a fost dezbrăcată și reprobată pentru Vav (panoul inferior).

      (A) Trombopoietina nu induce fosforilarea pleckstrinei sau a lanțului ușor de miozină. 32 de trombocite încărcate cu Pi au fost stimulate fie cu trombopoietină (100 ng/mL), fie cu trombină (1 U/mL). Lizatele de celule întregi au fost separate prin SDS-PAGE (gel de 7,5% până la 15%). Gelurile au fost uscate și autoradiografiate. Căile 1 și 6, trombocite în repaus; benzi 2 până la 5, 15 secunde, 1 minut, 5 minute, 10 minute după adăugarea trombopoietinei (100 ng/ml); benzi de la 7 la 9, 15 secunde, 1 minut, 2 minute după adăugarea de trombină (1 U/ml). Săgeata superioară indică poziția relativă a pleckstrinului; săgeata inferioară, lanț ușor miozină. (B) Efectele BAPTA-AM și Ro 31-8220 asupra fosforilării tirozinei a Vav indusă de trombină sau trombopoietină. Trombocitele au fost preincubate cu BAPTA-AM (40 μmol/L) și Ro-31-8220 (10 μmol/L) în prezența 1 mmol/L EGTA timp de 15 minute. După incubare, în suspensia de trombocite s-a adăugat trombină (1 U/mL, banda 2) sau trombopoietină (100 ng/mL, banda 3). După 10 minute, trombocitele au fost lizate prin adăugarea unei cantități egale dintr-un tampon conținând 2% Triton X-100. Fosforilarea cu tirozină a Vav a fost detectată ca în Fig 1 (panoul superior). Aceeași membrană PVDF utilizată în panoul superior a fost dezbrăcată și reprobată pentru Vav (panoul inferior).

      În mod interesant, rapoartele anterioare au indicat faptul că nici esterii forbolici, nici ionoforii de calciu nu au indus fosforilarea tirozinei Vav în alte tipuri de celule, 47.48 ridicând posibilitatea ca calea ulterioară să fie unică pentru trombocite. Pentru a evalua posibilitatea specificității tipului de celulă a fosforilării cu tirosină Vav, am examinat fosforilarea cu tirosină Vav în celulele FDCP-2, 3 exprimând c-Mpl uman (FDCP-hMPL5). Celulele FDCP-hMPL5 au fost tratate cu trombopoietină (100 ng/ml) de mai multe ori și lizate într-un tampon conținând 1% Triton X-100. Aceeași cantitate de proteină de 95 kD recunoscută de Vav a fost imunoprecipitată din celulele în repaus și stimulate de trombopoietină (Fig. 3A, panoul inferior). Aceeași proteină a devenit fosforilată cu tirozină după tratamentul cu trombopoietină (100 ng/ml) (Fig. 3A, panoul superior). Pe de altă parte, nici PMA (100 nmol/L), nici ionomicina (20 nmol/L) nu au indus fosforilarea tirozinei Vav în celulele FDCP-hMPL5 (Fig. 3B și C).

      Fosforilarea cu tirozină a Vav în celulele FDCP-hMpl5. (A) Fosforilarea tirozinei indusă de trombopoietină a Vav în celulele FDCP-hMpl5. Celulele FDCP-hMpl5 (10 7 celule/ml în PBS, pH 7,4) au fost lizate prin adăugarea unei cantități egale dintr-un tampon conținând 2% Triton X-100 înainte și după expunerea la trombopoietină (100 ng/ml) pentru diferite perioade conform indicațiilor. Vav a fost imunoprecipitat cu antiseruri specifice Vav. Complexele imune au fost resuspendate în tampon de probă SDS. Fosforilarea cu tirozină a Vav a fost detectată așa cum este descris în legenda din figura 1. (B și C) PMA sau ionomicina nu au reușit să inducă fosforilarea cu tirozină a Vav. Lizatele FDCP-hMpl5 au fost realizate așa cum este descris în (A), cu excepția cazului în care s-a folosit PMA (100 nmol/L) (B) sau ionomicină (20 nmol/L) (C).

      Fosforilarea cu tirozină a Vav în celulele FDCP-hMpl5. (A) Fosforilarea tirozinei indusă de trombopoietină a Vav în celulele FDCP-hMpl5. Celulele FDCP-hMpl5 (10 7 celule/ml în PBS, pH 7,4) au fost lizate prin adăugarea unei cantități egale dintr-un tampon conținând 2% Triton X-100 înainte și după expunerea la trombopoietină (100 ng/ml) pentru diferite perioade conform indicațiilor. Vav a fost imunoprecipitat cu antiseruri specifice Vav. Complexele imune au fost resuspendate în tampon de probă SDS. Fosforilarea cu tirozină a Vav a fost detectată așa cum este descris în legenda din figura 1. (B și C) PMA sau ionomicina nu au reușit să inducă fosforilarea cu tirozină a Vav. Lizatele FDCP-hMpl5 au fost realizate așa cum este descris în (A), cu excepția cazului în care s-a folosit PMA (100 nmol/L) (B) sau ionomicină (20 nmol/L) (C).

      DISCUŢIE

      c-vav este omologul celular al oncogenei v-vav.49-52 Produsul c-vav, p95vav (Vav) este exprimat predominant în celule hematopoietice și este indus de tirozină fosforilată în celule tratate cu o mare varietate de factori de creștere. În concordanță cu rapoartele anterioare care utilizează linii celulare, 53-56 am demonstrat că trombopoietina induce fosforilarea tirozinei Vav în celulele FDCP-hMpl5 care exprimă c-Mpl uman, un receptor pentru trombopoietină. Cu toate acestea, am extins aceste studii arătând că Vav este prezent în trombocite și că este indus de tirozină fosforilată în urma tratamentului cu trombopoietină. Aceste date sugerează că Vav poate avea un rol în semnalizarea prin trombopoietină. De asemenea, am constatat că Vav poate avea un rol în evenimentele de semnalizare postagregare la trombocite și în contrast cu fosforilarea Vav indusă de o varietate de alți agenți, trombopoietina induce fosforilarea tirozinei Vav fără activarea protein kinazei C.

      Unul dintre candidații pentru medierea fosforilării cu tirozină a Vav este Jak-2, deoarece trombopoietina, trombina, ionoforul de calciu sau esterul de forbol au fost raportate pentru a induce fosforilarea Jak-2. 2,6-9,46 Cu toate acestea, gradul de fosforilare Jak-2 indus de trombină a fost mult mai slab decât cel indus de trombopoietină, în timp ce ambii reactivi au provocat grade similare de fosforilare a Vav (Fig. 1 și datele nu sunt prezentate). Astfel, activarea Jak-2 poate să nu explice cu ușurință fosforilarea tirozinei Vav în trombocite stimulate de trombină.

      Anterior, a fost postulat un rol pentru tirozin kinaza, p72syk, în fosforilarea tirozinei Vav în macrofage. 56 Trombina, mimeticii tromboxanici și colagenul sunt cunoscuți pentru a induce fosforilarea tirozinei și activarea p72syk, chiar și atunci când agregarea trombocitelor este inhibată de peptida RGDS.62-65 Astfel, este posibil ca p72syk să fie implicat în fosforilarea tirozină a Vav indusă de acești agoniști. . Pe de altă parte, am constatat că p72syk nu a fost semnificativ tirozină fosforilată în trombocite stimulate de trombopoietină (date neprezentate). Aceste date, combinate cu datele de activare a protein kinazei C, demonstrează că tratamentul cu trombină și trombopoietină al trombocitelor are ca rezultat activarea diferențială a mai multor căi de semnalizare și este cel mai compatibil cu stimularea trombinei și trombopoietinei având căi separate pentru fosforilarea tirozinei Vav.

      În cele din urmă, Vav poate avea un rol în semnalizarea postagregării, după cum reiese din redistribuirea Vav către citoschelet după agregarea trombocitară stimulată de trombină. Acest lucru este similar cu ceea ce a fost descris pentru p60 c-src, p59 c-fyn, c-Cbl și integrina α IIbβ3. 4,34,36,45 Porțiunea amino terminală a Vav conține o regiune similară cu unele proteine ​​care leagă actina, cum ar fi calponina și α-actinina, care pot permite legarea Vav la actina filamentoasă. 52.66 Deoarece ștergerea porțiunii amino terminale a Vav duce la achiziționarea potențialului oncogen al Vav, 52 redistribuirea către citoschelet poate fi esențială pentru funcțiile normale ale Vav, spre deosebire de funcția oncogenă a Vav. Anterior, Vav s-a dovedit a fi asociat cu Grb2 în celulele hematopoietice. 11.44 Cu toate acestea, semnificația fiziologică a asocierii este necunoscută. Deoarece Vav este, de asemenea, asociat constitutiv cu Grb2, o proteină adaptoare SH2/SH3, în trombocite, Vav și Grb2 pot recruta mai multe molecule de semnalizare în citoschelet. Această ipoteză a fost susținută direct de constatarea noastră anterioară că Grb2 redistribuie și la citoscheletul trombocitar într-o manieră dependentă de agregare.

      În concluzie, datele noastre sugerează că există două căi care duc la fosforilarea tirozinei Vav în trombocite. Una dintre ele, declanșată de trombopoietină, nu pare să implice activarea fosfolipazei C și ar putea fi mediată de Jak2. Cealaltă cale poate fi în aval de activarea fosfolipazei C cu fosforilare modestă Jak-2. Cea din urmă cale ar putea implica p72syk. Datele noastre sugerează, de asemenea, că Vav poate avea un rol în evenimentele de agregare, deoarece am constatat că Vav se redistribuie în citoschelet în timpul agregării plachetare și este un substrat endogen pentru calpain.

      CONFIRMARE

      Mulțumim doctorilor Junichi Kambayashi, Thomas J. Kunicki, Amgen, Inc. și Green Cross Co pentru furnizarea de reactivi cu amabilitate. Mulțumim, de asemenea, Dr. Akihiko Shimosaka pentru încurajarea sa continuă și pentru comentariile sale utile.

      Y.M. și A.O. au contribuit în mod egal la acest studiu și ar trebui să fie considerați ca primii autori.

      Sprijinit parțial de subvenții de la Ministerul Educației, Științei și Tehnologiei din Japonia (YI și AO), Fundația Ryoichi Naito pentru Cercetări Medicale (AO) și Granturi de Cercetare pentru Științe ale Vieții și Medicină, Fondul Keio University pentru Științe Medicale ( AO).

      Adresați solicitări de reimprimare către Atsushi Oda, MD, dr., Departamentul de Medicină Internă, Școala de Medicină, Universitatea Keio, 35 Shinanomachi, Shinjuku-ku, Tokyo 160, Japonia.