Ting Jia

1 Departamentul de știință clinică, intervenție și tehnologie, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia

indusă

2 Medicină renală și Baxter Novum, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia

Hannes Olauson

1 Departamentul de Știință Clinică, Intervenție și Tehnologie, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia

Carolina Lindberg

1 Departamentul de știință clinică, intervenție și tehnologie, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia

Risul Amin

1 Departamentul de știință clinică, intervenție și tehnologie, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia

Karin Edvardsson

1 Departamentul de știință clinică, intervenție și tehnologie, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia

Bengt Lindholm

2 Medicină renală și Baxter Novum, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia

Göran Andersson

3 Departamentul de patologie, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia

Annika Wernerson

1 Departamentul de știință clinică, intervenție și tehnologie, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia

Yves Sabbagh

4 Centrul de cercetare și dezvoltare Sanofi-Genzyme, Genzyme, A Sanofi Company, Framingham, SUA

Susan Schiavi

4 Centrul de cercetare și dezvoltare Sanofi-Genzyme, Genzyme, A Sanofi Company, Framingham, SUA

Tobias E Larsson

1 Departamentul de știință clinică, intervenție și tehnologie, Institutul Karolinska, Stockholm, Suedia

5 Departamentul de Nefrologie, Spitalul Universitar Karolinska, Stockholm, Suedia

Date asociate

Abstract

fundal

Modelele in vivo de uremie sunt instrumente importante pentru a studia numeroase aspecte ale bolilor renale acute și cronice. Modelele de șoareci sunt esențiale, deoarece majoritatea modelelor animale modificate genetic sunt șoareci, care permit disecarea impactului genelor țintă selectate în insuficiența renală. Protocoalele bazate pe adenină pentru inducerea insuficienței renale sunt disponibile la șobolani, dar nu au fost adaptate la șoareci din cauza reticenței lor de a consuma adenină. În lucrarea actuală am dezvoltat o metodă nouă pentru inducerea insuficienței renale prin livrarea dietetică de adenină amestecată într-o dietă bazată pe cazeină.

Rezultate

După o fază de inducție, s-a obținut un model stabil de insuficiență renală (intervalul ureei țintă 80-100 mg/dl), imitând mai multe aspecte ale bolii renale cronice - tulburări minerale și osoase incluzând hiperparatiroidismul secundar, anomalii osoase și creșterea patologică a FGF23. Nu s-au produs decese și nivelul uremiei a fost adaptabil prin ajustări ale conținutului de adenină, oferind avantaje semnificative în comparație cu modelele existente. Într-un studiu demonstrativ de 8 săptămâni, histologia renală a arătat în principal o leziune tubulointerstițială cu leucocite infiltrante, edem interstițial și lărgirea spațiului Bownman. Fibroza a fost prezentă la majoritatea animalelor, așa cum este definită de histologie și modificări ale expresiei genice a markerilor de fibroză. Proliferarea celulelor paratiroide a fost semnificativ crescută, dar fără semne de hipertrofie glandulară. Istologia scheletului a arătat o adipozitate crescută a osului trabecular și a măduvei osoase, în timp ce biomarkerii osoși (CTX și PINP) au sugerat o formare osoasă mai mare, dar în mod surprinzător, resorbția osoasă mai mică și perturbări în metabolismul mineral.

Concluzii

Prezentăm o metodă nouă, non-chirurgicală, pentru inducerea insuficienței renale la șoareci. Acesta este un complement important la modelele uremice existente pentru studii fiziopatologice în bolile renale acute și cronice, în special în ceea ce privește leziunile tubulointerstițiale.

fundal

Boala renală cronică (ERC) este o povară globală pentru sănătate [1], totuși lipsesc în prezent tratamente eficiente pentru prevenirea, progresia și complicațiile asociate. Modelele animale de insuficiență renală sunt instrumente importante pentru studierea evenimentelor fiziopatologice în bolile renale, care permit studii translaționale care vizează îmbunătățirea managementului pacienților cu CKD. Datorită disponibilității ridicate a tulpinilor de șoarece modificate genetic, modelele de șoareci uremici oferă posibilitatea de a investiga impactul genelor țintă specifice în cadrul insuficienței renale.

Tehnicile stabilite pentru inducerea insuficienței renale la șoareci sunt în mare parte dependente de intervențiile chirurgicale. Cele mai răspândite metode utilizate în prezent sunt obstrucția unilaterală ureterală [2-7], care duce la fibroza interstițială prin infiltrarea macrofagelor și moartea celulelor tubulare prin apoptoză și necroză și nefrectomia 5/6 [8,9]. Cea din urmă tehnică implică de obicei două proceduri separate, primele două treimi ale unui rinichi sunt distruse prin electrocoagulare și după recuperare se efectuează o nefrectomie contra-laterală. Modelul de nefrectomie 5/6 are mai multe limitări, incluzând o rată substanțială a mortalității atunci când nu este efectuată în mod adecvat, non-reversibilitate și modificări fenotipice legate de procedura chirurgicală, mai degrabă decât afectarea funcției renale [10]. Metoda este, de asemenea, asociată cu variații relativ mari interindividuale și interlaboratoare, iar disponibilitatea acesteia poate fi compromisă de lipsa expertizei chirurgicale și a instalațiilor de operare adecvate.

Pentru a ocoli aceste obstacole, ne-am propus să stabilim un model nou, non-chirurgical, de insuficiență renală la șoareci, utilizând un protocol bazat pe adenină. Important, există protocoale bine caracterizate pentru insuficiența renală indusă de adenină la șobolani, totuși această tehnică nu a fost adaptată la șoareci din cauza aversiunii lor la hrănirea cu adenină.

Metode

Experimente pe animale

Experimentele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale experimentelor pe animale ale Institutului Karolinska și protocolul de studiu a fost aprobat de comitetul etic regional (comitetul etic Stockholm Sud, numărul de aprobare S184-10 și apendicele S19-13). Șoarecii C57BL/6J de 8 săptămâni au fost adăpostiți în cuști standard cu așternut de așchii de lemn și o rolă de hârtie pentru îmbogățire la temperatura ambiantă constantă (21-22 ° C) și umiditate (40-50%) cu un ciclu de lumină de 12 ore . Toate animalele au avut acces gratuit la apa de la robinet și la dieta atribuită. Înainte de începerea studiului, tuturor șoarecilor li s-a permis să se aclimatizeze la condițiile facilității animale și la chow pe bază de cazeină într-o perioadă de 7 zile.

Pentru a oferi un chow care conține adenină consumat de șoareci, adenina a fost amestecată cu o dietă pe bază de cazeină care a tocit mirosul și gustul. Adenina a fost achiziționată de la Sigma Aldrich (MO, SUA) și dieta pe bază de cazeină sub formă de pudră de la Special Diets Services (SDS, UK) (numărul de referință 824522). Alte ingrediente ale dietei sunt amidonul de porumb (39,3%), cazeina (20,0%), maltodextrina (14,0%), zaharoza (9,2%), uleiul de porumb/porumb (5%), celuloza (5%), amestecul de vitamine (1,0 %), DL-metionină (0,3%) și bitartrat de colină (0,2%). Conținutul total de fosfați a fost de 0,9%, iar conținutul total de calciu a fost de 0,6%.

Datele prezentate aici sunt derivate dintr-un experiment de 8 săptămâni folosind șoareci de tip sălbatic C57BL/6J de 8 săptămâni. Pentru a exclude posibilitatea unui impact al dietei de cazeină pe vedere pe funcția renală, grupul de control (n = 5) a fost alimentat cu aceeași dietă de cazeină ca și grupul de adenină (n = 9), dar fără adaos de adenină.

Biochimia serului și a urinei

Sângele a fost colectat după puncție cardiacă la sacrificiu și prin incizie a venei cozii la puncte de timp intermediare. Urina a fost colectată ca probe de urină la fața locului după urinarea spontană. Concentrațiile serice și urinare de calciu, fosfor, creatinină și uree au fost măsurate pe un Konelab 20XTi (Thermo Scientific, Finlanda). Concentrațiile de creatinină au fost validate cu un test colorimetric (BioChain, CA, SUA), obținând rezultate aproape identice (rho = 0,95 și respectiv 0,98 pentru ser și respectiv creatinină în urină) în comparație cu tehnica Konelab. PTH a fost măsurată cu un kit de șoarece PTH ELISA intact (Immutopics, CA, SUA), FGF23 cu un FGF23 ELISA intact (Kainos, Japonia) și 1,25 (OH) 2D, CTX și PINP cu kituri EIA (Immunodiagnostic Systems, UK).

Histologie

Rinichii și glandele paratiroide au fost fixate în 4% formaldehidă, încorporate în parafină și secționate conform procedurilor standard. Oasele au fost decalcificate într-un tampon conținând 20% acid formic. Toate țesuturile au fost supuse colorării Hematoxilinei și Eozinei. Secțiunile renale au fost, de asemenea, colorate pentru colorarea periodică a acidului Schiff (PAS) pentru polizaharide și mucoase (VWR International, Suedia), Trichrome (Ladewig) pentru mușchi și colagen (Histolab Products AB, Suedia) și von Kossa pentru țesutul mineralizat (VWR International), conform instrucțiunilor producătorului. Rinichii și oasele au fost evaluate într-un mod orbit de către un patolog renal experimentat (AW) și respectiv patolog os (GA). Imunohistochimia a fost efectuată conform protocoalelor standard folosind un anticorp monoclonal anti-Ki67 de iepure (SP6 1: 400, Thermo Scientific, CA, SUA) și un anticorp anti-mieloperoxidază de iepure (A398 1: 100, Dako, Danemarca). Indicele de proliferare în glandele paratiroide a fost calculat ca numărul de celule Ki67 pozitive împărțit la numărul total de celule în patru secțiuni consecutive.

Alizarină roșie și calcificare vasculară

Partea toracică-abdominală a aortei (n ≥ 5 din fiecare grup) a fost disecată, împărțită longitudinal și așezată plat. Țesutul a fost incubat cu soluție de colorare S roșu de alizarină 1% (Alfa Aesar, Germania) la temperatura camerei timp de 10 minute și spălat de trei ori cu etanol 70% timp de 20 de minute fiecare.

Analiza transcrierilor renale

Rinichii au fost omogenizați folosind un TissueLyzer LT (Qiagen, Olanda) și ARN-ul total a fost extras folosind E.Z.N.A. Total ARN Kit I (Omega Bio-tek, GA, SUA). ADN-ul a fost îndepărtat cu E.Z.N.A. Set DNase fără RNase (Omega Bio-tek). ADNc de prima catenă a fost sintetizat utilizând kitul de sinteză iADN cScript (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA).

Pentru analiza qPCR în timp real, s-au folosit sistemul de detecție PCR în timp real CFX96 și iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Expresia relativă a genei a fost calculată utilizând metoda 2-ΔΔ Cq normalizând gena de interes pentru β-actină din aceeași probă.

Statistici

GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, CA, SUA) a fost utilizat pentru analiza statistică. Toate valorile sunt exprimate ca medie ± SEM, cu excepția cazului în care se specifică altfel. Diferențele dintre șoareci tratați cu adenină și martori au fost calculate utilizând testul non-parametric Mann-Whitney. Valori P 1. Studiul a fost precedat de o fază de adaptare de 7 zile a dietei cu cazeină fără adăugarea de adenină și a cuprins o fază de inducție de 10 zile (ziua 0-9) și o fază de întreținere (ziua 10-56). În timpul fazei de întreținere, conținutul de adenină a fost modificat așa cum este descris mai sus în intervalul 0,15-0,20% pentru a atinge nivelul dorit de uree de 80-100 mg/dL. De remarcat, scăderea concentrației de adenină în zilele 15 și 40, de la 0,2% la 0,15%, a dus la o scădere rapidă a nivelurilor de uree și PTH. Cu toate acestea, reversibilitatea pe termen lung și îmbunătățirile histologice după retragerea adeninei nu au fost examinate.

Vedere schematică a studiului de 8 săptămâni cu dovezi de concept a insuficienței renale indusă de adenină la șoareci. Studiul a fost precedat de o fază de adaptare de 7 zile și a cuprins o fază de inducție de 10 zile (ziua 0-9) și o fază de întreținere (ziua 10-56).

Greutatea corporală și biochimia serului/urinei

Modificările temporale ale greutății corporale și markerii funcției renale sunt descriși în Figura 2 A. A existat o scădere semnificativă a greutății corporale în timpul fazei de inducție, dar a fost stabilizată și practic nealterată în timpul fazei de întreținere. În conformitate cu rapoartele anterioare, ureea părea a fi un marker mai precis al uremiei decât creatinina, în timp ce raportul dintre creatinină și greutatea corporală a fost egal cu nivelurile de uree [11]. Scăderea raportului dintre uree urină/uree serică și creatinină urină/creatinină serică a confirmat eliminarea redusă a acestor metaboliți (Figura 2 A). Important, șoarecii expuși la adenină nu au avut proteinurie crescută în comparație cu martorii. Acest lucru se explică probabil prin rezistența cunoscută a tulpinii C57BL/6 la dezvoltarea proteinuriei în combinație cu natura tubulointerstițială a afectării renale în acest model [12].

Greutatea corporală și parametrii biochimici în timpul studiului. A: Greutatea corporală și parametrii funcției renale în timpul studiului. WeightGreutate corporală (sus): Greutatea corporală a fost redusă în timpul fazei de inducție de 10 zile în grupul tratat cu adenină, dar a rămas stabilă în timpul fazei de întreținere până la punctul final. Markerii funcției renale: uree serică, creatinină serică/greutate corporală, uree urină/uree serică și creatinină urină/creatinină serică au indicat o rată redusă a clearance-ului renal la șoarecii tratați cu adenină. * p 2 B. Similar pacienților cu CKD, grupul cu adenină a dezvoltat o hiperfosfatemie semnificativă, hiperparatiroidism secundar și FGF23 sever crescut, paralel cu o excreție urinară crescută de fosfor [13]. Nu a existat nicio modificare a excreției urinare de calciu (p = 0,66 pentru valoarea inițială față de punctul final). La sfârșit, CTX a fost semnificativ redusă, în timp ce a existat o creștere semnificativă la limită a PINP la șoarecii tratați cu adenină, comparativ cu șoarecii din dieta de control, sugerând o resorbție osoasă redusă, dar o creștere a formării osoase (Figura 2 B).

Histologie

Analiza histologică a rinichilor, glandelor paratiroide și a oaselor este prezentată în Figura 3 A-C și în Fișa suplimentară 1: Figura S1. Istologia renală a arătat o infiltrare leucocitară peritubulară și edem interstițial/peritubular, reflectând faptul că leziunile renale sunt în principal tubulointerstitiale. Imunocolorarea pozitivă pentru mieloperoxidază a confirmat că leucocitele peritubulare erau în principal formate din granulocite neutrofile. (Fișier suplimentar 2: Figura S2). O creștere a spațiului Bowman a fost văzută în unele, dar nu în toate glomerulii. Micro-abcese focale au fost prezente în unele, dar nu în toate, specimenele de țesut examinate în grupul adenină. Un rezumat al constatărilor histopatologice la rinichi este furnizat în Tabelul 1 .

Parametrii atrofiei tubulare, resturile celulare/materialul necrotic și leucocitele polimorfonucleare (PMN) în lumina tubulară, tiroidizarea, fibroza interstițială și inflamația interstițială sunt clasificate după cum urmează: 0; care afectează 0-5% din zona renală, 1; 6-25%, 2; 26-50% și 3; > 50%. Datele sunt prezentate ca mediană (interval). Structurile cristalide/amorfe rotunjite din lumina tubulară, dilatația focală și depunerile focale de calciu din tubuli sunt clasificate ca prezente sau absente. Morfologia navei este clasificată ca fiind patologică sau normală.

Determinarea ariei din glandele paratiroide secționate în serie nu a evidențiat hipertrofie glandulară evidentă. În schimb, rata de proliferare în paratiroizi determinată de indicele Ki67 a fost crescută (Figura 3 B) și în conformitate cu nivelul crescut de PTH la șoarecii tratați cu adenină. Secțiunile de femuri au prezentat o trabeculă osoasă extinsă și o adipozitate crescută a măduvei osoase, în concordanță cu modelul seric al markerilor osoși PINP și CTX. Colorările roșii de alizarină nu au arătat nicio calcificare vasculară evidentă în aortele toracice ale șoarecilor expuși adeninei (Fișa suplimentară 3: Figura S3).

Modificări ale expresiei genice a markerilor inflamatori și fibroză locali

Am analizat nivelurile de transcriere a unui număr de gene activate local asociate cu inflamația și fibroza renală [14,15]. Markerii inflamatorii Mmp3 (Gene ID: 17392), Mmp9 (17395), Il7rα (16197), Ccl20 (20297) și Ccl5 (20304) au fost reglementați în mod semnificativ la șoarecii tratați cu adenină (Figura 4 A), în timp ce Cxcr2 a fost neschimbat ( datele nu sunt afișate). Markerii corespondenți ai fibrozei Tgfb1 (21803), Col1a1 (12842) și Ccl2 (20296) au fost reglementați în mod semnificativ la șoareci pe o dietă cu adenină (Figura 4 B). Exemple utilizate pentru analiza qPCR în timp real sunt prezentate în fișierul suplimentar 4: Tabelul S1.

Exprimarea genelor inflamatorii și fibrozei derivate renale. A) Markeri inflamatori Mmp3, Mmp9, Il7rα, Ccl20 și Ccl5 și B) Markerul fibrozei Tgfb1, Col1a1 și Ccl2 au fost suprareglate la șoareci tratați cu adenină. Expresia relativă a genei în grupul martor este setată la 1. bare albe; grup de control, bare negre; grupa adenină. *** p (12M, pdf)

Imunocolorarea pozitivă pentru mieloperoxidază a confirmat că leucocitele peritubulare erau în principal formate din granulocite de neutrofile.

Colorarea în roșu cu alizarină a segmentelor reprezentative din aorta toracică. Nu a fost găsită nicio calcificare vasculară la șoareci martori sau tratați cu adenină.

Lista grundurilor utilizate pentru analiza qPCR în timp real.

Mulțumiri

Dorim să mulțumim Christinei Hammarstedt, Anneli Hansson, Maria Norgård și personalului din centrul animalelor de la AKM6, Spitalul Universitar Huddinge pentru asistența lor valoroasă.

Dezvăluiri

Studiul a fost inițiat de investigator și condus și susținut de subvenții academice de la Fundația suedeză pentru cercetare strategică, Consiliul suedez de cercetare (K2012-55P-22137-01-06), Fundația suedeză pentru rinichi, Institutul Karolinska și Spitalul universitar Karolinska YS și SS sunt angajați ai Sanofi-Aventis. TEL este angajat cu jumătate de normă al Astellas.