Qi Qiao

un Departament de Biologie Umană, Școala de Nutriție și Cercetare Translațională în Metabolism NUTRIM, Centrul Medical al Universității Maastricht, Maastricht, Olanda

Freek G. Bouwman

un Departament de Biologie Umană, Școala de Nutriție și Cercetare Translațională în Metabolism NUTRIM, Centrul Medical al Universității Maastricht, Maastricht, Olanda

Marleen A. van Baak

un Departament de Biologie Umană, Școala de Nutriție și Cercetare Translațională în Metabolism NUTRIM, Centrul Medical al Universității Maastricht, Maastricht, Olanda

Nadia J. T. Roumans

b Institutul de Medicină Regenerativă Inspirată din Tehnologie, MERLN, Centrul Medical al Universității Maastricht, Maastricht, Olanda

Roel G. Wink

un Departament de Biologie Umană, Școala de Nutriție și Cercetare Translațională în Metabolism NUTRIM, Centrul Medical al Universității Maastricht, Maastricht, Olanda

Susan L. M. Coort

c Departamentul de Bioinformatică, Școala de Nutriție și Cercetare Translațională în Metabolism NUTRIM, Centrul Medical al Universității Maastricht, Maastricht, Olanda

Johan W. Renes

un Departament de Biologie Umană, Școala de Nutriție și Cercetare Translațională în Metabolism NUTRIM, Centrul Medical al Universității Maastricht, Maastricht, Olanda

Edwin C. M. Mariman

un Departament de Biologie Umană, Școala de Nutriție și Cercetare Translațională în Metabolism NUTRIM, Centrul Medical al Universității Maastricht, Maastricht, Olanda

Date asociate

ABSTRACT

Introducere

Excesul de greutate și obezitatea sunt factori de risc majori pentru diverse complicații de sănătate, cum ar fi diabetul de tip II, tulburările cardiovasculare, apneea de somn și anumite tipuri de cancer [1-4]. Prevalența supraponderalității și a obezității crește în întreaga lume și până în prezent nici o țară nu și-a inversat cu succes epidemia [5-7]. Remediile obezității sunt pierderea în greutate prin intervenție dietetică, activitate fizică crescută, tratament farmacologic sau tratament chirurgical [1,8-10]. Cu toate acestea, până la 80% dintre persoanele care slăbesc în urma unei diete cu conținut scăzut de energie își recuperează de obicei greutatea și adesea revin la greutatea lor inițială sau chiar dincolo de aceasta, în decurs de unul sau doi ani [2,11-17]. Fenomenul obișnuit al recâștigării greutății nu numai că face mai puțin eficientă reducerea greutății corporale, ci pare să inducă și o creștere a riscului de complicații metabolice [18]. Ca atare, ciclismul cu greutatea este o problemă esențială a supraponderalității și a obezității [5,14,19]. Prin urmare, este important să obțineți mai multe cunoștințe cu privire la condițiile și mecanismele de recuperare a greutății după pierderea în greutate, pentru a păstra greutatea redusă și îmbunătățirile de sănătate însoțitoare.

Rezultate

Modificările morfologice ale picăturilor de grăsime adipocite în timpul restricționării glucozei și al alimentării

ces1

Prezentare schematică a proiectului studiului. Pre-adipocitele SGBS la momentul T0 au fost diferențiate timp de 14 zile. Apoi, adipocitele mature au fost folosite pentru a începe un grup de control pentru hrănirea normală (4 zile) și un grup de testare pentru restricția glucozei (4 zile) și realimentare (4 zile). GR: restricție de glucoză, RF: realimentare.

Înregistrarea adipocitelor SGBS mature în timpul experimentului. a: adipocite mature la punctul de timp T14, b: adipocite la T18, c: adipocite la T18GR, d: adipocite la T22RF. a, b, c, d sunt afișate toate la o mărire de 400 × de către sistemul camerei microscopice. GR: restricție de glucoză, RF: realimentare.

Diametrul picăturilor de grăsime pentru diferitele etape experimentale începând cu T14.

Analiza proteomică a restricției de glucoză (T14 vs T18GR)

Restricția glucozei și realimentarea

Pentru experimentele GR, adipocitele mature (T14) au fost cultivate în DMEM/F12 (1: 1) fără glucoză și roșu fenol (Cell Culture Technologies), suplimentate cu 20 nmol/L insulină umană și 0,1 mmol/L glucoză timp de 96 h (T18GR ). Ca martor, adipocitele mature (T14) provenite din aceleași pre-adipocite au fost cultivate 96 de ore în mediu normal de hrănire: același mediu DMEM/F12 suplimentat cu 20 nmol/L insulină umană și 17,5 mmol/L D-glucoză (T18) [ 49].

Pentru experimentele RF, după 96 h sub GR, celulele au fost cultivate în mediu DMEM/F12 suplimentat cu 20 nmol/L insulină umană și 17,5 mmol/L D-glucoză pentru încă 96 h (T22RF). Începând cu T14, mediul a fost reîmprospătat ușor în fiecare a doua zi.

Monitorizarea dimensiunii picăturilor de grăsime

Diametrul mediu al tuturor picăturilor de grăsime măsurabile este o subreprezentare a diametrului mediu al tuturor picăturilor de grăsime. Prin urmare, am decis să determinăm diametrul mediu al celor mai mari cinci picături de grăsime ca parametru legat de cifra de afaceri a grăsimii stocate în timpul hrănirii, GR și RF [50]. În detaliu, creșterea celulară a fost înregistrată îndeaproape începând cu T0 folosind un microscop Nikon Eclipse TS100 echipat cu o unitate de control al camerei cu microscop digital Sight (DS-L3), (Nikon). După ziua 14, în fiecare a doua zi au fost alese aleatoriu pe imagine aproximativ 300 de adipocite. Între timp, în fiecare figură înregistrată la o mărire de 400 ×, cele mai mari cinci picături de grăsime pe celulă au fost selectate prin ochi și diametrele lor au fost măsurate. Dacă nu a fost posibilă selectarea prin ochi, s-au măsurat diametrele celor mai mari opt picături, iar cele mai mari cinci au fost selectate pe baza valorilor măsurate. În cele din urmă, am calculat diametrul mediu al celor mai mari cinci picături de grăsime.

Colorare cu ulei roșu O (ORO)

Celulele au fost spălate de două ori cu PBS, apoi incubate cu 3,7% formaldehidă timp de 1 oră. În timpul incubației, numărul de adipocite a fost determinat folosind un ocular raster. După clătirea celulelor cu Milli-Q și etanol 70%, lichidul a fost complet aspirat. 0,5 grame de ulei roșu O (Sigma-Aldrich) s-au dizolvat în 50 mL izopropanol (Sigma-Aldrich), 30 mL din această soluție s-au amestecat cu 20 mL apă Milli-Q și s-au filtrat printr-un dispozitiv de 0,2 µmol/L. Celulele aspirate au fost colorate cu această soluție de lucru ORO timp de 30 de minute. După colorare, celulele au fost spălate de 8 ori 30 s cu etanol 70%, apoi spălate de două ori cu Milli-Q timp de 5 minute și în cele din urmă celulele au fost dizolvate în 2 mL DMSO (Sigma-Aldrich). Valoarea OD a fost determinată la 540 nm. Valoarea ORO a fost corectată pentru numărul de celule după cum urmează: valoarea corectată OD = (valoarea măsurată OD/cantitatea de celule) × 10 5 .

Izolarea proteinelor

Pentru izolarea proteinelor, celulele au fost colectate la fiecare dintre punctele de timp de mai sus, atât pentru grupul de control, cât și pentru grupul de testare. În detaliu, godeurile cu celule cultivate au fost spălate de două ori cu tampon PBS și lizate cu tampon SDT (2% dodecil sulfat de sodiu/50 mmol/L ditiotreitol/100 mmol/L Tris-HCI pH = 7,6), 300 pl per godeu. Celulele au fost răzuite cu un răzuitor de celule (Corning) și lizatul a fost colectat în tuburi, apoi încălzit la 95 ° C timp de 5 minute. După încălzire, probele au fost sonicate în trei cicluri de 20 s și centrifugate la 16000 × g timp de 5 minute la 20 ° C și apoi supernatantul a fost transferat cu atenție într-un alt tub. Toate probele au fost depozitate la -80 ° C pentru digestia proteinelor și LC-MS/MS. Întregul experiment a fost efectuat de trei ori și pentru fiecare experiment au fost disponibile 3 godeuri de celule pentru fiecare izolare proteică în toate momentele.

Pregătirea și digestia probei de proteine

Dispozitivele de filtrare centrifugă Amicon Ultra 0,5 ml (Sigma-Aldrich) au fost îmbibate peste noapte cu 5% Tween 20. Dispozitivele de filtrare au fost spălate prin imersiune în Milli-Q timp de 10 minute cu agitare de 600 rpm, apoi s-au adăugat 500 MilL Milli-Q și s-au adăugat dispozitive de filtrare au fost centrifugate la 14000 × g la 20 ° C timp de 25 min. Ulterior, unitatea de filtrare a fost introdusă într-un flacon de colectare a filtratului. Proba de proteine ​​a fost adăugată în unitatea de filtrare, centrifugată la 14000 × g la 20 ° C timp de 30 de minute. După ce soluția din flaconul de colectare a fost aruncată, filtrul a fost inversat și centrifugat la 2000 rpm la 20 ° C timp de 2 minute.

Pentru alchilare, 50 uL din proba concentrată cu filtru a fost amestecată cu 50 mmol/L iodoacetamidă într-un volum de 500 uL și incubată timp de 30 min în întuneric. Întregul volum a fost transferat în dispozitivul de filtrare și centrifugat la 14000 × g la 20 ° C timp de 30 de minute. Apoi, au fost întreprinse mai multe etape pentru îndepărtarea dodecil sulfatului de sodiu și a ditiotreitolului. 500 uL de 8 mol/L uree suplimentată cu deoxicolat de sodiu 4% au fost adăugate în dispozitivul de filtrare și centrifugate la 14000 × g la 20 ° C timp de 45 de minute. Această etapă a fost repetată de două ori cu 500 olL de 8 mol/L uree și apoi de două ori cu 50 mmol/L bicarbonat de amoniu. Apoi, proba concentrată de proteine ​​a fost colectată prin inversarea unității de filtrare și centrifugare la 1000 × g timp de 5 min. Concentrația de proteine ​​a fost determinată utilizând testul proteinei BCA din microplacă conform protocolului producătorului (Pierce, Thermo Fisher Scientific; 23252). Pentru digestia proteinelor, 42 de proteine ​​proteice din punctele de timp T14, T18, T18GR, T22RF au fost suplimentate cu 1 µg tripsină/Lys-C Mix (Thermo Fisher Scientific; V5073) și incubate timp de 9-14 ore la 37 ° C.

Desalinizarea probei

Identificarea proteinelor folosind LC-MS/MS

Un instrument HPLC nanoflow (Ultimate 3000, Dionex) a fost cuplat on-line la un spectrometru de masă Q Exactive (Thermo Scientific) cu o sursă de ioni Flex nano-electrospray (Proxeon). Concentrația finală a amestecului digestiv/peptidic etichetat TMT a fost 0,33 μg/µL și 5 µL din acest amestec a fost încărcat pe o coloană de fază inversată C18 (Thermo Scientific, coloană Acclaim PepMap C18, 75-μm diametru interior x 15 cm, 2 -μm dimensiunea particulelor). Peptidele au fost separate cu un gradient liniar de 120 min de 4-68% tampon B (80% acetonitril și 0,08% acid formic) la un debit de 300 nL/min.

Datele MS au fost achiziționate folosind o metodă top-10 dependentă de date, alegând dinamic cei mai abundenți ioni precursori din scanarea sondajului (280-1400 m/z) în modul pozitiv. Scanările sondajului au fost achiziționate la o rezoluție de 70.000 și un timp maxim de injecție de 120 ms. Durata excluderii dinamice a fost de 30 de secunde. Izolarea precursorilor a fost efectuată cu o fereastră de 1,8 m/z și un timp maxim de injecție de 200 ms. Rezoluția pentru spectrele HCD a fost setată la 30.000, iar energia de coliziune normalizată a fost de 32 eV. Raportul de subumplere a fost definit ca 1,0%. Instrumentul a fost rulat cu modul de recunoaștere a peptidelor activat, dar excluderea ionilor încărcați individual și a stărilor de încărcare mai mari de cinci.

Căutare baze de date, cuantificare, normalizare și analiză a căilor

Datele MS au fost căutate utilizând motorul de căutare Proteome Discoverer 2.2 Sequest HT (Thermo Scientific), în baza de date umană UniProt. Rata de descoperire falsă (FDR) a fost stabilită la 0,01 pentru proteine ​​și peptide, care trebuiau să aibă o lungime minimă de șase aminoacizi. Toleranța de masă a precursorului a fost stabilită la 10 ppm și toleranța la fragment la 0,02 Da. O scindare a fost tolerată, oxidarea metioninei a fost stabilită ca o modificare dinamică și carbamidometilarea cisteinelor, aductilor de reactivi TMT (+229.162932 Da) pe lizină și termenii amino peptidici au fost stabiliți ca modificări fixe. Datele fiecărei curse au fost normalizate la cantitatea totală de peptide din fiecare canal și pentru a compara între curse scalate la punctul de timp T18. Schimbările cuantificate ale proteinelor identificate au fost folosite pentru a efectua analiza și vizualizarea căii de către versiunea 3.3.0 a software-ului PathVisio [28,52].

Colectarea datelor din studiu in vivo

Pentru a compara modificările proteomice in-vitro și in-vivo și a explora în continuare relația posibilă cu recâștigarea greutății, au fost extrase din studiul Yoyo 53 de participanți umani, cuantificarea proteomului și datele de analiză a microarray-urilor (număr de înregistrare:> NCT01559415 [53],). Procesul de colectare a datelor a fost prezentat într-o diagramă de flux (a se vedea figura suplimentară 4). Pe scurt, studiul Yoyo a reprezentat un studiu de intervenție de scădere în greutate/de urmărire pe 61 de persoane supraponderale/obeze. S-au făcut măsurători antropometrice și s-au prelevat probe, inclusiv biopsii de țesut adipos, înainte de scăderea în greutate (T1), după o dietă (foarte) scăzută de calorii timp de 5 săptămâni sau 3 luni pentru a pierde aproximativ 8% din greutatea corporală (T2), după 4 săptămâni menținută pe o dietă echilibrată (T3) și după o perioadă de urmărire de 9 luni (T4). Cuantificarea proteinelor și analiza microarray-ului au fost efectuate așa cum s-a descris anterior [54]. Modificări ale nivelului de ARN de la T1 la T3 au fost obținute din datele analizei microarray. Datele ARN la T4 nu erau disponibile. Modificări ale nivelului de proteine ​​de la T1 la T4 au fost colectate din datele de cuantificare a proteinelor.

Analize statistice

Datele au fost prezentate ca medie ± SEM. Analizele statistice au fost efectuate folosind versiunea 22.0 SPSS pentru Windows 10 (SPSS Inc., Chicago, IL, SUA). Schimbarea ori (FC) a fost calculată în timpul alimentării continue, respectiv GR și RF. Toate variabilele au fost verificate pentru distribuția normală prin testul lui Shapiro-Wilk, P> 0,05 a fost considerat pragul pentru distribuția normală. Pentru variabilele cu distribuție normală, testul t asociat a fost utilizat pentru a compara valorile dintr-un grup în diferite momente de timp; testul t independent a fost utilizat pentru comparația între grupul de control și grupul de testare. Pentru variabilele cu o distribuție înclinată, a fost utilizat testul Wilcoxon. Coeficienții de corelație ai lui Spearman Rho au fost calculați pentru relațiile dintre parametri în diferite momente de timp. În analizele statistice, P (25M, zip)