Analiza Western blot a extractelor din celule HT29, netratate sau tratate cu nocodazol (50ng/ml), utilizând anticorp Phospho-PBK/TOPK (Thr9) (superior) sau PBK/TOPK Anticorp # 4942 (inferior).

Anticorpul Phospho-PBK/TOPK (Thr9) 4941

thr9

Analiza Western blot a extractelor din celule HT29, netratate sau tratate cu nocodazol (50ng/ml), utilizând anticorp Phospho-PBK/TOPK (Thr9) (superior) sau PBK/TOPK Anticorp # 4942 (inferior).

  • Reprezentantul local
  • Informațiile dvs. locale de cumpărare
  • Garantează anticorpii
  • FAQ
  • Suport tehnic
  • Date suport
  • produse asemanatoare
  • Utilizarea produsului
  • Protocoale
  • fundal
  • Căi și proteine
  • Referințe și recenzii

Date suport

REACTIVITATE H
SENSIBILITATE Endogen
MW (kDa) 40
SURSĂ Iepure

Cheie de aplicare:

  • W-Occidental
  • IP-Imunoprecipitare
  • IHC-Imunohistochimie
  • CIP-Imunoprecipitarea cromatinei
  • DACĂ-Imunofluorescența
  • F-Citometrie în flux
  • E-P-ELISA-peptidă

Cheia de reactivitate încrucișată a speciilor:

  • H-Uman
  • M-Șoarece
  • R-Război
  • Hm-Hamster
  • Mk-Maimuţă
  • Noi-Nurcă
  • C-Pui
  • Dm-D. melanogaster
  • X-Xenopus
  • Z-Zebrafish
  • B-Bovin
  • Dg-Câine
  • Pag-Porc
  • Sc-S. cerevisiae
  • Ce-C. elegans
  • HR-Cal
  • Toate-Toate speciile așteptate
PBK/TOPK Anticorp # 4942
Setul de prelevare a anticorpului pentru determinarea fazei ciclului celular # 17498
Kitul de prelevare de anticorpi Phospho-p53 # 65390
Phospho-cdc2 (Tyr15) (10A11) Rabbit mAb # 4539
cdc2 (POH1) Mouse mAb # 9116
cdc2 (E1Z6R) Rabbit mAb # 28439
Cyclin B1 (D5C10) XP ® Rabbit mAb # 12231
Anticorp Phospho-cdc2 (Thr161) # 9114
Anticorp Phospho-cdc2 (Thr14) # 2543
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) Rabbit mAb # 2348

Informații despre utilizarea produsului

Depozitare

Livrat în 10 mM sodiu HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCI, 100 μg/ml BSA și 50% glicerol. A se păstra la –20 ° C. Nu alicotați anticorpul.

Protocol

Protocolul Western Blotting

Pentru Western blots, incubați membrana cu anticorp primar diluat în 5% greutate/volum BSA, 1X TBS, 0,1% Tween ® 20 la 4 ° C cu agitare ușoară, peste noapte.

NOTĂ: Vă rugăm să consultați pagina web a produsului anticorp primar pentru diluarea recomandată a anticorpilor.

A. Soluții și reactivi

De la pregătirea eșantionului până la detectare, reactivii de care aveți nevoie pentru Western Blot sunt acum într-un singur kit convenabil: # 12957 Western Blotting Application Solutions Kit

NOTĂ: Pregătiți soluții cu osmoză inversă deionizată (RODI) sau apă de calitate echivalentă.

B. Blotarea proteinelor

Un protocol general pentru prepararea probei.

  1. Tratați celulele prin adăugarea de medii noi care conțin regulator pentru timpul dorit.
  2. Aspirați mass-media din culturi; spălați celulele cu 1X PBS; aspirat.
  3. Lizați celulele adăugând 1X tampon de probă SDS (100 perl per godeu de placă cu 6 godeuri sau 500 (l pentru o placă de 10 cm diametru). Îndepărtați imediat celulele de pe placă și transferați extractul într-un tub de microcentrifugă. Păstrați pe gheață.
  4. Sonicați timp de 10-15 secunde pentru a finaliza liza celulară și tăiați ADN-ul (pentru a reduce vâscozitatea probei).
  5. Se încălzește un eșantion de 20 de probe la 95-100 ° C timp de 5 minute; rece pe gheață.
  6. Microcentrifuga timp de 5 min.

Încărcați 20 de ontol pe gelul SDS-PAGE (10 cm x 10 cm).

NOTĂ: Se recomandă încărcarea markerilor de greutate moleculară preconizați (# 13953, 5 µl/bandă) pentru a verifica electrotransferul și scara de proteine ​​biotinilate (# 7727, 10 µl/bandă) pentru a determina greutățile moleculare.

  • Electrotransfer la membrana de nitroceluloză (# 12369).

    • C. Blocarea membranei și incubațiile de anticorpi

    NOTĂ: Volumele sunt pentru membrană de 10 cm x 10 cm (100 cm 2); pentru membrane de dimensiuni diferite, reglați volumele în mod corespunzător.

    I. Blocarea membranei

    1. (Opțional) După transfer, spălați membrana de nitroceluloză cu 25 ml TBS timp de 5 minute la temperatura camerei.
    2. Se incubează membrana în 25 ml de tampon de blocare timp de 1 oră la temperatura camerei.
    3. Se spală de trei ori timp de 5 min fiecare cu 15 ml TBST.

    II. Incubația primară a anticorpilor

    1. Incubați membrana și anticorpul primar (la diluarea și diluantul adecvat, așa cum se recomandă în pagina web a produsului) în 10 ml tampon de diluare a anticorpului primar cu agitare ușoară peste noapte la 4 ° C.
    2. Se spală de trei ori timp de 5 min fiecare cu 15 ml TBST.
    3. Incubați membrana cu IgG anti-iepure, anticorp legat de HRP (# 7074 la 1: 2000) și anti-biotină, anticorp legat de HRP (# 7075 la 1: 1000–1: 3000) pentru a detecta markeri de proteine ​​biotinilate în 10 ml de tampon de blocare cu agitare ușoară timp de 1 oră la temperatura camerei.
    4. Se spală de trei ori timp de 5 min fiecare cu 15 ml TBST.
    5. Continuați cu detectarea (secțiunea D).

    D. Detectarea proteinelor

    Instrucțiunile de utilizare:

    1. Se spală HRP legat de membrană (anticorp conjugat) de trei ori timp de 5 minute în TBST.
    2. Pregătiți 1X Reactiv ECL SignalFire ™ (# 6883) prin diluarea unei părți Reactiv 2X A și o parte Reactiv B 2X (de exemplu, pentru 10 ml, adăugați 5 ml Reactiv A și 5 ml Reactiv B). Amesteca bine.
    3. Se incubează substratul cu membrană timp de 1 minut, se îndepărtează soluția în exces (membrana rămâne umedă), se înfășoară în plastic și se expune la film cu raze X.

    * Evitați expunerea repetată la piele.

    postat în iunie 2005

    revizuit în iunie 2020

    Specificitate/Sensibilitate

    Anticorpul Phospho-PBK/TOPK (Thr9) detectează nivelurile endogene de PBK/TOPK numai atunci când este fosforilat la treonină 9.

    Reactivitatea speciilor:

    Sursă/purificare

    Anticorpii policlonali sunt produși prin imunizarea animalelor cu o fosfopeptidă sintetică corespunzătoare aminoacizilor din jurul Thr9 al PBK/TOPK uman. Anticorpii sunt purificați prin proteina A și cromatografie de afinitate.

    fundal

    PBK/TOPK este o serină/treonin kinază care este fosforilată și activă în timpul mitozei (1). PBK/TOPK este compus din subdomenii de kinază și un domeniu de legare PDZ carboxi-terminal, despre care se crede că interacționează cu proteina supresoare tumorale hDlg (1). Creșterea expresiei PBK/TOPK a fost observată în liniile celulare maligne foarte proliferative, iar expresia PBK/TOPK este puternic reglată în jos în timpul diferențierii terminale a celulelor leucemice HL-60 (2,3). Activitatea kinazei indusă de PMA către PBK/TOPK a fost observată (4) și s-a demonstrat că cdc2/ciclinB fosforilează PBK/TOPK in vitro, probabil la Thr9 (1). Substraturile potențiale ale PBK/TOPK includ p38 MAPK și c-Myc (3,4).

    Căi și proteine

    Explorează căi + proteine ​​legate de acest produs.