Editat de Robert W. Berliner, Școala de Medicină a Universității Yale, New Haven, CT și aprobat pe 14 septembrie 1998 (primit pentru revizuire 5 august 1998)

tiazidă

Abstract

Hormonul mineralocorticoid aldosteron reglează excreția urinară de sodiu prin creșterea ratei de absorbție renală a sodiului epitelial (1). Se consideră că situl principal al acțiunii aldosteronului în rinichiul mamiferelor este canalul colector cortical, unde aldosteronul reglează intrarea apicală de sodiu prin canalul de sodiu epitelial sensibil la amiloride (1-3). Cu toate acestea, rezultatele recentelor studii de micropunctură renală (4) și studiile de legare a [3H] metolazonei în membranele corticale renale (4, 5) sugerează că tubul distal contorsionat este un situs suplimentar al tubului renal de acțiune mineralocorticoidă. Intrarea apicală de sodiu în tubul distorsionat este mediată de un cotransportor sensibil la tiazidă Na-Cl (TSC) (6). Astfel, este probabil ca acțiunile presupuse ale aldosteronului să regleze transportul de sodiu în tubul contort distal ar rezulta din reglarea căii de intrare Na-Cl sensibile la tiazidă.

Investigația funcției și reglării TSC a fost facilitată de clonarea recentă a ADNc-urilor pentru cotransportor din vezica urinară (7) și rinichi de șobolan (8), ceea ce a condus la dezvoltarea instrumentelor moleculare pentru localizarea expresiei TSC. Pe baza experimentelor care utilizează hibridizarea in situ (9) și transcripția inversă - PCR (10), s-a ajuns la concluzia că mARN-ul TSC a fost găsit practic exclusiv în tubulul distal contorsionat din rinichiul șobolanului. Studiile imunohistochimice care utilizează anticorpi derivați de proteine ​​de fuziune la TSC au demonstrat, de asemenea, că expresia proteinei TSC în rinichiul de șobolan este limitată la celulele distale ale tubulului convoluit (11).

Ipotezăm aici că aldosteronul poate acționa asupra tubulului distal încurcat pentru a crește expresia TSC a tubului distal încurcat. Pentru a aborda această ipoteză, am dezvoltat un anticorp policlonal derivat din peptide la TSC. Folosind acest anticorp, am efectuat experimente de imunoblotare și imunofluorescență care demonstrează că creșterile nivelurilor circulante de mineralocorticoizi, indiferent dacă sunt obținute prin restricție dietetică de NaCl sau prin administrare de mineralocorticoizi, duc la o creștere semnificativă a expresiei proteinei TSC în tubul distorsionat. Astfel, TSC al tubului renal distal complicat pare a fi o țintă importantă pentru reglarea mediată de aldosteron a excreției renale de clorură de sodiu.

METODE

Anticorpi policlonali.

Pentru imunocitochimie, studiile de față au utilizat, de asemenea, anticorpi monospecifici purificați de afinitate la Na + –K + –2Cl - cotransportor sensibil la bumetantid al membrului ascendent gros și la schimbătorul Na + –Ca 2+, un marker de conectare a tubulilor. Anticorpul Na + –K + –2Cl - cotransportor este un anticorp policlonal de pui (LC20) crescut într-o peptidă sintetică corespunzătoare aminoacizilor 33-55 din cotransportorul de șobolan, pe baza secvenței publicate de Gamba și colab. (7). Acest anticorp a dat o suprapunere completă a marcării cu anticorpul nostru policlonal caracterizat anterior de iepure la cotransportorul Na + –K + –2Cl - (13) în experimentele cu dublă etichetare la șobolan (datele nu sunt prezentate). Anticorpul la schimbătorul Na + –Ca 2+ este mAb de șoarece (Affinity BioReagents, Golden, CO).

Animale și protocoale experimentale.

Șobolani Sprague-Dawley masculi fără patogeni (ferme taconice) cu greutatea de 180-220 g au fost folosiți în acest studiu.

Studiu de restricție NaCl dietetic.

Studiu de perfuzie cu aldosteron.

Șobolanii au fost anesteziați cu metoxifluran (methofan; Pitman - Moore, Mundelein, IL) și minipompele osmotice (model 2ML2; Alzet, Palo Alto, CA) au fost implantate subcutanat pentru a livra 200 μg de aldosteron (Sigma) pe zi. Această rată de livrare pentru aldosteron a fost aleasă pentru a atinge niveluri plasmatice de aldosteron de aproximativ 1000 ng/dl, pe baza observațiilor publicate (16). Aldosteronul a fost inițial dizolvat în dimetil sulfoxid și diluat cu soluție salină izotonică înainte de instalare. Șobolanilor martor li s-au implantat minipumpuri care conțin vehicul singur. Fiecare șobolan a fost hrănit cu o dietă gelificată (preparată așa cum este descris mai sus), oferind o cantitate fixă ​​zilnică de NaCI (58 mg/200 g BW), apă deionizată (25 ml/200 g BW) și chow de bază pentru șobolan (15 g/200 g BW) pe toată durata studiului. Cantitatea de Na din această dietă a fost de 1,0 meq/200 g BW pe zi. După 10 zile de tratament, șobolanii au fost uciși pentru imunoblotare semiquantitativă așa cum este descris mai jos.

Studiu de administrare a fludrocortizonului.

Șobolanii martori și tratați au fost hrăniți o dată pe zi cu o dietă gelificată conținând o cantitate fixă ​​zilnică de apă deionizată (25 ml/200 g BW), NaCl (125 mg/200 g BW), șobolanul de bază (15 g/200 g BW) și 0,5% agar. Pentru șobolanii tratați, fludrocortizonul (Sigma) a fost dizolvat în apă la o concentrație de 50 mg/litru și a fost utilizat la realizarea dietei gelificate. Doza de fludrocortizon a corespuns la 1,2 mg/200 g BW pe zi. După 7 zile de tratament, șobolanii au fost uciși pentru imunoblotare semiquantitativă așa cum este descris mai jos.

Imunoblotarea.

Imunoblotarea semiquantitativă a fost efectuată așa cum este descris (17) pentru a evalua nivelurile relative de expresie ale TSC utilizând omogenate întregi din rinichi întregi ai șobolanilor preparați așa cum este descris mai sus în Animale și Protocoale experimentale. Pe scurt, rinichii întregi au fost omogenizați utilizând un omogenizator de țesuturi (Omni 1000 echipat cu un generator de dinți de ferăstrău) în soluție de izolare rece ca gheața (pH 7,6) conținând 250 mM zaharoză, 10 mM trietanolamină (Calbiochem), 1 μg/ml leupeptină ( Bachem) și 0,1 mg/ml fluorură de fenilmetilsulfonil (Statele Unite Biochimice) și concentrația totală de proteine ​​(kit de acid bicinchoninic (BCA); Pierce) a fost ajustată la 1,2 μg/μl cu soluție de izolare. Probele au fost solubilizate în 5 × tampon de probă Laemmli (1 vol per 4 vol de probă) urmat de încălzire la 60 ° C timp de 15 minute. Gelurile inițiale SDS/poliacrilamidă colorate în albastru Coomassie au confirmat că probele au fost potrivite în ceea ce privește conținutul de proteine.

Pentru imunoblotare, SDS/PAGE a fost efectuată utilizând minigeluri de poliacrilamidă 7,5%, iar proteinele au fost transferate electroforetic pe membranele nitrocelulozice așa cum este descris (13). După blocarea cu 5 g/dl lapte uscat fără grăsime, membranele au fost sondate cu anticorp policlonal purificat de afinitate la TSC (L573) la o concentrație IgG de 0,2 μg/ml într-o soluție tampon de diluare a anticorpului conținând 150 mM NaCI, 50 mM fosfat de sodiu, 10 mg/dl azidă de sodiu, 50 mg/dl Tween 20 și 1 g/dl BSA (pH 7,5). Anticorpul secundar a fost IgG anti-iepure de măgar conjugat cu peroxidază de hrean (Pierce; nr. Catalog 31458) utilizat la o concentrație de 0,16 μg/ml. Locurile de reacție anticorp - antigen au fost vizualizate utilizând chemiluminescență îmbunătățită pe bază de luminol (LumiGLO; Kirkegaard și Perry Laboratories) înainte de expunerea la film cu raze X (Kodak nr. 165-1579 film imagistic științific). Controalele au fost efectuate așa cum este descris în Rezultate, folosind antiserul purificat prin afinitate preadorbit cu peptida imunizantă.

Caracterizarea anticorpului anti-TSC prin imunoblotare. (A) Imunoblot al fracției de membrană brută (17.000 × g pelete de la supernatant de 4.000 × g centrifugare) de cortex renal de șobolan (10 μg de proteină totală pe bandă) sondat cu anti-TSC purificate prin afinitate [concentrație Ig G, 0.2 μg/ml, banda stângă] sau același anticorp preadorbit cu 1 mg de peptidă imunizantă (banda dreaptă). (B) Imunoblot care prezintă localizarea regională a TSC în rinichi de șobolan. Fiecare bandă a fost încărcată cu o fracție de membrană brută obținută din cortex, medulă exterioară (OM) și medulă internă (IM), respectiv (10 μg de proteină totală pe bandă). (C) Imunoblot care prezintă rezultatele centrifugării diferențiale a omogenatului cortical de la șobolan efectuată așa cum este descris (12). Prima bandă, pelete de la centrifugare la 17.000 × g timp de 20 de minute după centrifugarea inițială la 1.000 × g timp de 10 minute la 4 ° C. A doua bandă, pelete de la centrifugare la 200.000 × g timp de 1 oră. A treia bandă, supernatant de la 200.000 × g centrifugare. Fiecare bandă a fost încărcată cu 10 μg de proteine ​​totale. Banda predominantă de 165 kDa este prezentată în fracțiunile de membrană (pelete de la 17.000 × g și 200.000 × g centrifugare), în timp ce este absentă din fracția citosolică (supernatant final).

FIG. 2 prezintă imagini de sondaj cu putere foarte mică a cortexului renal al unui șobolan martor netratat pregătit pentru a evalua distribuția generală a etichetării anti-TSC. FIG. 2A arată marcarea numai cu anticorpul anti-TSC. Rețineți că anticorpul anti-TSC etichetează segmente de tubuli scurți în cortex, care sunt distribuiți anizotrop, în concordanță cu demonstrația anterioară că TSC este exprimat în principal, dacă nu exclusiv, în tubul contort distal (9-11). FIG. 2B arată aceeași regiune ca și Fig. 2A cu triplă etichetare pentru TSC, transportorul de absorbție Na - K - 2Cl al membrului ascendent gros și schimbătorul Na - Ca, un marker de tubul de legătură. Rețineți că există puține sau deloc suprapuse etichetări observate pentru acești trei anticorpi, sugerând că etichetarea anti-TSC nu se extinde nici la membrul ascendent gros, nici la tubul de legătură. FIG. 2C este un control de etichetare care arată că marcarea cu anticorpul anti-TSC a fost ablată atunci când anticorpul a fost preadorbit cu un exces de peptidă imunizantă.

Localizarea imunofluorescenței de foarte mică putere a TSC în cortexul renal de șobolan. (A) Numai etichetarea TSC. (B) Marcare triplă cu anticorp policlonal anti-TSC de iepure (verde), un anticorp policonal de pui la membrul ascendent gros Na + –K + –2Cl - cotransportor (albastru) și un anticorp monoclonal de șoarece împotriva Na + –Ca 2 + schimbător, un marker tubular de conectare (roșu). C arată că nu a fost detectată nicio marcare atunci când anticorpul anti-TSC a fost pre-absorbit cu un exces de peptidă imunizantă. (Bară, 250 μm.)

Efectul restricției dietetice a sării asupra expresiei TSC.

Efectul restricției dietice NaCl asupra expresiei TSC în rinichiul de șobolan. (A) Imunoblot al omogenatului de rinichi întreg de la șobolani Sprague - Dawley care ingerează Na dietetică de 2,2 meq/200 g BW pe zi (martor) sau 0,2 meq/200 g BW pe zi (NaCl scăzut). Fiecare bandă a fost încărcată cu o probă de proteine ​​de la un șobolan diferit. Blotul a fost încărcat cu 10 μg de proteine ​​totale pe bandă. (B) Gel SDS/12% poliacrilamidă colorat în albastru Coomassie folosind aceleași probe ca cele utilizate în imunoblot în A. Acest gel de încărcare a stabilit că imunoblotul însoțitor (încărcat identic, Fig. 3A) a fost încărcat uniform. (C) Imunoblot de control utilizând aceleași probe, dar testat cu un anticorp policlonal de iepure la proteina cotransportor Na-K-2Cl (13). Blotul a fost încărcat cu 7 μg de proteine ​​totale pe bandă.

FIG. 4 prezintă etichetarea imunofluorescentă a tubilor distali învolți reprezentativi în secțiuni corticale de la șobolani hrăniți cu dieta de control (Fig. 4A) și dieta cu conținut scăzut de NaCl (Fig. 4B). Etichetarea este predominant apicală în ambele condiții. Astfel, expresia corticală crescută observată în imunobloti nu este asociată cu o redistribuire majoră a TSC în celulele distorsionate.

Localizarea prin imunofluorescență a anticorpului anti-TSC în secțiuni corticale de la șobolani hrăniți cu control (A) și cu un conținut scăzut de NaCl (B). O creștere a etichetării TSC a tubilor distorsionați de la șobolani din dieta cu conținut scăzut de NaCl este detectată comparativ cu șobolanii hrăniți cu dieta de control. Condițiile de etichetare și setările microscopului confocal sunt identice pentru A și B. (Bar, 25 μm.)

Efectul administrării de mineralocorticoizi exogeni asupra expresiei TSC.

Efectul mineralocorticoizilor exogeni asupra expresiei TSC în rinichi de șobolan. Imunoblotii au fost tratați cu 10 μg de proteine ​​pe banda de omogenate de rinichi întregi de la șobolani Sprague-Dawley și au fost testați cu anti-TSC. Gelurile SDS preliminare/12% poliacrilamidă au fost rulate și au fost colorate cu albastru Coomassie pentru a confirma egalitatea de încărcare în fiecare bandă (nu este prezentată). (A) Nivelul proteinei TSC a fost semnificativ crescut prin administrarea orală de 7 zile de fludrocortizon (Fludro) comparativ cu martorul. (B) Nivelul proteinei TSC a fost semnificativ crescut cu perfuzie subcutanată de aldosteron (ALDO) timp de 10 zile, comparativ cu controlul administrat de vehicul.

DISCUŢIE

TSC este exprimat în tubul distal învolburat al rinichiului și este responsabil pentru o fracțiune mare din reabsorbția netă de sodiu și clorură care are loc în porțiunea distală a tubului renal de mamifer (6). Pe baza efectelor observate ale tiazidelor asupra excreției de NaCl și a fenotipului de pierdere a sării observat în asociere cu mutațiile genei sale (sindromul Gitelman) (19, 20), TSC este considerat a fi esențial pentru conservarea normală a NaCl de către rinichi. Cu toate acestea, investigația reglementării sale a fost limitată de faptul că nu a fost practic să se izoleze și să se perfuzeze in vitro tubii distilați convoluți, lăsând tehnicile in vivo dificile din punct de vedere tehnic ca singurul mijloc de evaluare a funcției sale (vezi Introducere). În general, un segment de tubul renal mai distal, și anume canalul colector, a fost dedus a fi locul în care reabsorbția de sodiu este reglată de aldosteron (1-3), iar tubul distal convoluat nu a fost recunoscut pe scară largă ca un sit major de acțiune aldosteronică. Studiul actual oferă totuși dovezi că o reglare importantă din punct de vedere fiziologic de către aldosteron are loc în tubul contort distal și că TSC este o țintă pentru reglarea de către aldosteron.

Un pas preliminar necesar pentru prezentul studiu a fost dezvoltarea și caracterizarea unui anticorp policlonal de iepure care recunoaște proteina TSC cu un grad ridicat de specificitate. Pentru a realiza acest lucru, s-a folosit ca imunogen o peptidă sintetică purificată prin HPLC (legată de o proteină purtătoare adecvată). Peptida imunizantă a fost aleasă pentru a maximiza specificitatea anticorpului prin utilizarea programului de computer blast pentru a compara peptidele candidate cu toate proteinele din bazele de date combinate cu proteine. Secvența aleasă nu a arătat nici o suprapunere semnificativă cu nici o proteină eucariotă cunoscută, inclusiv cotransportorii înrudiți, exprimați în rinichi și alte țesuturi epiteliale. O serie de experimente preliminare care utilizează imunoblotarea, centrifugarea diferențială și imunolocalizarea imunofluorescentă au asigurat că acest anticorp recunoaște în mod specific cotransportorul sensibil la tiazidă al tubului distorsionat renal.

Concluzia principală din prezentul studiu este că mineralocorticoizii reglează puternic expresia TSC în tubul distal contorsionat, efect care este probabil să aibă un impact major asupra capacității de absorbție a NaCl a tubului distal contorsionat. Rezultatele a trei experimente diferite susțin această concluzie. În primul rând, restricția NaCl dietetică timp de 10 zile la șobolani a crescut nivelul seric de aldosteron de 5 ori și a crescut concomitent abundența de TSC în rinichi cu mai mult de 100% din valoarea de control pe baza imunoblotării (Fig. 3A). Acest efect pare a fi selectiv, deoarece abundența cotransportatorului gros și ascendent al membrului Na - K - 2Cl nu a crescut. În al doilea rând, perfuzia de aldosteron timp de 10 zile a reprodus creșterea expresiei TSC observată în studiile dietetice de restricție NaCl (Fig. 5B). În al treilea rând, administrarea orală a unui mineralocorticoid sintetic, fludrocortizon, timp de 7 zile a dus, de asemenea, la o reglare marcată a expresiei TSC (Fig. 5A). Astfel, studiile prezente oferă dovezi directe că TSC este o proteină importantă indusă de aldosteron.

Prezentul studiu are, de asemenea, implicații importante în ceea ce privește reglarea excreției de clorură. Se consideră că reabsorbția renală de sodiu este reglementată direct de aldosteron și că modificările asociate excreției de clorură apar secundar efectelor primare asupra transportului de sodiu. Prezentele rezultate, împreună cu observațiile citate mai sus, implică faptul că atât excreția de sodiu, cât și cea de clorură pot fi direct reglementate de aldosteron, așa cum postulează Crabbe (29).

Studiile de micropunctură ale segmentelor superficiale de nefroni ale șobolanului au demonstrat că tubul distal al șobolanului este responsabil pentru reabsorbția a 6-8% din sarcina filtrată de sodiu, în timp ce sistemul de conducte colectoare reabsorbe 1% sau mai puțin din sarcina filtrată ( 30). Deși porțiunea tubului distal evaluată în mod normal prin micropunctură este o combinație a tubului distal complicat, tubul de legătură și tubul colector inițial (31), cea mai mare parte a absorbției distale de sodiu observate are loc în prima jumătate a tubului distal accesibil la micropunctură (30), adică în tubul distorsionat în sine. Prin urmare, tubulii distilați convoluți reprezintă probabil o absorbție de sodiu considerabil mai mare decât se produce în conductele colectoare. Prin urmare, având în vedere creșterile marcate ale abundenței TSC demonstrate aici ca răspuns la administrarea aldosteronului, o componentă majoră a acțiunii aldosteronului în scăderea excreției renale de sodiu este probabil o consecință a acțiunii aldosteronului asupra tubului distorsionat.

Mulțumiri

Autorii îi mulțumesc lui David H. Ellison pentru furnizarea anticorpului său anti-TSC folosit pentru a confirma rezultatele cheie ale acestui studiu și W. Saul și J. Carducci pentru asistență tehnică. Finanțarea acestui studiu a fost primită din bugetul intramural al Institutului Național de Inimă, Plămân și Sânge (Institutul Național de Sănătate Proiect Z01-HL-01282-KE către M.A.K.) și Institutul Național de Sănătate Grant DK27847 către J.B.W. Utilizarea instalației de microscop confocal pentru imunolocalizări a fost finanțată de Grantul BIR9318061 al National Science Foundation.

Note de subsol

Cui căruia i se adresează cererile de reimprimare la: Institutele Naționale de Sănătate, Clădirea 10, Camera 6N260, 10 Center Drive MSC 1603, Bethesda, MD 20892-1603. e-mail: knephelix.nih.gov .

Această lucrare a fost trimisă direct (pista II) la biroul de proceduri.