Abstract

Acidul docosahexaenoic (DHA) este o componentă structurală majoră a sistemului nervos, iar epuizarea poate duce la pierderi ale funcției neuronale. Obiectivul nostru a fost de a demonstra un deficit de performanță a sarcinii spațiale la șobolani cu DHA creier scăzut datorită unui aport scăzut de acizi grași n-3 folosind o tehnică de creștere artificială de prima generație. Puii de șobolan nou-născuți au fost separați pe d 2 și repartizați la două grupuri de creștere artificială sau la un grup de control crescut cu baraj. Puii au fost hrăniți manual cu lapte artificial prin intermediul sticle de îngrijire personalizate care conțin fie 0,02% (n-3 Def), fie 3,1% (n-3 Adq) din totalul acizilor grași ca LNA. La data de 21, șobolanii au fost înțărcați cu diete cu granule n-3 Def sau n-3 Adq și mai multe sarcini comportamentale au fost evaluate la vârsta de 9 săptămâni. DHA pentru creier a fost mai mic (58% și 61%, p

Multe studii au demonstrat acum că consumul prelungit de o dietă cu deficit de acid gras n-3 a dus la pierderea DHA creierului și a retinei, ducând la pierderi ale funcției neuronale (1-5). De exemplu, scăderea DHA cerebrală a fost asociată cu o performanță mai slabă la sarcinile simple de învățare asociativă (6-8), modificări ale electroretinogramelor (9-13) și performanța sarcinii spațiale la rozătoare (14-16). Munca noastră anterioară a arătat că șobolanii pe o dietă cu deficit de acizi grași n-3 de-a lungul a două generații au avut un defect în sarcinile de discriminare olfactivă cu două mirosuri (17,18) și în învățarea setului olfactiv (19). În aceste studii, DHA creierului a scăzut cu 83%, cu compensarea cu o creștere a creșterii DPAn-6 a creierului. Sugarii cu maimuță Rhesus hrăniți cu acizi grași n-3 - dietele deficitare au avut o durată crescută a aspectului (20), în timp ce maimuțele suplimentate cu 1% DHA și 1% AA în timpul dezvoltării timpurii au prezentat abilități motorii și de orientare mai puternice.

O limitare a abordării deficienței în două generații este că aceasta imită prost situația umană. Deși aportul acizilor grași n-3 cu lanț mai lung, EPA și DHA sunt destul de scăzute în lumea occidentală, în special în America de Nord (27), unde există un aport mediu al precursorului L-n-3 de aproximativ 1,5 g/d (28-30). Acest lucru se reflectă în grupurile circulante de acizi grași n-3, deoarece, de exemplu, procentul de acizi grași n-3 serici total la americani a fost de doar 2,5%, în timp ce procentul în japoneză a fost de 9-11,8% (31). Aceste niveluri scăzute sunt rezultatul aportului scăzut de EPA și DHA preformate împreună cu rata scăzută de conversie metabolică a LNA în EPA și DHA in vivo (32). Cu toate acestea, un nivel moderat al aportului de acizi grași n-3 este capabil să susțină, într-o oarecare măsură, creierul și retina DHA (33,34), deoarece pare să fie acumulat împotriva unui gradient de concentrație. Acest lucru nu înseamnă că nivelurile creierului în cazul aportului scăzut de acizi grași n-3 sunt aceleași cu cele cu niveluri mai ridicate de aport de DHA preformat (33,35,36), o observație care poate avea relevanță pentru creșterea literatura psihiatrică care asociază aportul de acizi grași n-3 cu tendința către dezvoltarea diferitelor afecțiuni psihiatrice (37-39).

Pentru multe studii pe animale, este necesară o scădere semnificativă a DHA creierului pentru a produce o scădere măsurabilă a funcției organului sau a organismului (22). Mai precis, se pare că poate fi necesară o pierdere cu 50% sau mai mare de DHA pentru a observa astfel de diferențe (22,40). Astfel, un model de deficit de acizi grași n-3 care imită mai bine situația umană, dar care produce în continuare un declin substanțial al DHA al creierului și al retinei, ar fi foarte valoros pentru dezvoltarea acestui câmp.

Recent, s-au făcut eforturi în laboratorul nostru (41,42) pentru a dezvolta un model din prima generație a deficitului de acizi grași n-3 utilizând o abordare de creștere artificială inițiată de Hoshiba (43,44). Această metodă folosește un raft de alimentare care conține șase mameloane din siliciu din care animalele pot fi învățate să se hrănească. Cu toate acestea, în mâinile noastre, supraviețuirea puilor a fost slabă din cauza dificultăților cu ajustarea rezistenței mamelonului, care a fost esențială pentru o rată de curgere adecvată la alăptarea puilor. Hoshiba a îmbunătățit această metodă prin introducerea unui nou tip de biberon pentru hrănirea manuală, care duce la o supraviețuire mult mai bună a puilor (45). Aceste metode sunt unice prin faptul că permit creșterea artificială (AR) a puilor de șobolani din prima zi de viață. Tehnica de hrănire manuală cu sticlele nou dezvoltate a fost astfel utilizată pentru lucrarea de față.

În acest experiment, barajele au fost hrănite cu o dietă conținând 3% în greutate LNA, o dietă „n-3 adecvată”. Puii lor au fost hrăniți cu lapte artificial de șobolan începând cu a doua zi de viață. În acest mod, s-a obținut controlul total al aportului de nutrienți și de acizi grași esențiali, în special. Dietele artificiale cu lapte de șobolan au fost formulate după metoda Kanno și colab. (46), dar au fost modificate astfel încât să ofere niveluri foarte scăzute de acizi grași n-3 sau o dietă care conține 3% în greutate LNA. Au fost caracterizate pierderea de DHA cerebrală asociată cu o dietă cu deficit de acid gras n-3 și performanța puilor în mai multe sarcini comportamentale. Măsurătorile activității locomotorii și ale activității pe labirintul ridicat plus au fost făcute ca controale pentru punctul final cheie al performanței sarcinii spațiale în labirintul de apă Morris. Performanța sarcinii spațiale a constat în măsurarea latenței de evadare pe o perioadă de 4 zile, așa cum sa stabilit anterior pentru un model de două generații de deficit de acizi grași n-3, precum și un test de probă în care platforma a fost îndepărtată în testul de înot ( 16.22). Ipoteza noastră a fost că hrănirea dietei cu deficit de acizi grași n-3 de la scurt timp după naștere până la vârsta adultă ar duce la o scădere semnificativă a DHA creierului și că acest lucru ar duce la pierderi ale performanței sarcinii spațiale.

MATERIALE ȘI METODE

Animale și design de studiu.

Sistem de creștere artificială.

deficiența

Aparate de alimentare dezvoltate de Hoshiba (45).

Laptele artificial de șobolan.

Dietele peletate.

Cele trei diete cu granule utilizate s-au bazat pe formularea AIN-93 (47) cu mai multe modificări pentru a obține nivelul de acid gras n-3 extrem de scăzut necesar în acest studiu (Tabelul 1). Dietele cu granule personalizate au fost obținute comercial și au fost utilizate un proces de granulare la rece pentru a conserva grăsimile nesaturate (Dyets, Bethlehem, PA). Dietele au fost concepute pentru a conține un profil de acizi grași foarte similar cu cel din laptele artificial de șobolan (sau laptele de baraj) pentru fiecare grupă. Variabila dependentă în cele două grupuri crescute artificial a fost înlocuirea esterului etilic al-linolenat cu o porțiune a esterului etilic oleatic în dieta Ad-n-3. Dieta maternă conținea o compoziție acilă grasă similară celei din dieta n-3 Adq, dar a fost alcătuită dintr-un amestec de șofrănel și uleiuri de in (mai degrabă decât esteri etilici purificați) datorită cantității mai mari de dietă care trebuie consumată. Toate cele trei diete conțineau 10% în greutate ca grăsime și aveau un conținut similar de LA. Șobolanii au fost menținuți pe dieta adecvată peletată după înțărcare până când au fost uciși.

Test de activitate motorie.

Activitatea motorie a animalelor a fost înregistrată folosind un analizor de imagine video (Videomax V, Columbus Instruments, Columbus, OH). Fiecare șobolan a fost plasat individual la 0930-1300 h într-o cușcă (25 cm × 45 cm × 20 cm) și timpul de mișcare și distanța de mișcare au fost măsurate timp de 30 de minute.

Plus-labirint ridicat.

Pentru a măsura comportamentul legat de anxietate, a fost utilizat plus-labirintul crescut (48,49). Labirintul plus a fost ridicat la 70 cm deasupra podelei și a constat din două brațe deschise opuse (45 cm × 15 cm) și două brațe închise opuse. Traseul fiecărui animal a fost observat timp de 5 minute după o perioadă de odihnă de 2 minute în pătratul central al labirintului. Aceste măsurători au fost repetate timp de 2 zile. Au fost înregistrate numărul de intrări în brațele deschise și timpul de vizitare a brațelor deschise.

Testul labirintului de apă Morris.

Compoziția lipidică.

După experimentele comportamentale la vârsta de 15 săptămâni, șobolanii au fost uciși prin decapitare. Probele de țesut, inclusiv creierul și retina, au fost îndepărtate și depozitate la -80 ° C. Extractele lipidice totale din țesuturi au fost preparate conform metodei Folch și colab. (50). Extractele lipidice au fost transmetilate cu 14% BF3-metanol la 100 ° C timp de 60 min printr-o modificare a metodei Morrison și Smith (51) cu adăugare de hexan (52). Lipidele totale din laptele artificial și dietele peletice au fost extrase prin metoda Lepage și Roy (53). Esterii metilici ai acizilor grași au fost apoi analizați prin cromatografie gazoasă așa cum s-a descris anterior (52). Esterii metilici ai acizilor grași au fost identificați prin comparație cu timpii de retenție ai unui amestec standard (Nu-Check Prep 462). Concentrațiile de acizi grași individuali și totali au fost obținute utilizând un standard intern (22: 3n-3 ca ester metilic, 432 μg/creier și 64,8 μg/retină).

analize statistice.

Toate datele au fost exprimate ca medie ± SEM și semnificația a fost determinată utilizând ANOVA unidirecțional utilizând Statistica (StatSoft, Tulsa, OK). Experimentele comportamentale au fost analizate folosind testul cu interval multiplu al lui Duncan atunci când analizele inițiale ANOVA cu măsuri repetate au dus la diferențe semnificative. Greutatea corporală și diferențele compoziționale ale acizilor grași au fost analizate folosind testul onest al diferenței semnificative a lui Tukey.

REZULTATE

Greutate corporala.

Puii crescuți artificial au avut o greutate corporală semnificativ mai mică decât cea a puilor crescuți cu baraj din ziua 2 până la 14, dar nu au existat diferențe semnificative între grupurile de lapte adecvate pentru acidul gras n-3 și grupele de lapte adecvate pentru acidul gras n-3 [F(2,31) = 58.594, p Figura 2

Compoziția creierului și a acizilor grași retinieni.

Metoda de creștere artificială a fost utilă în obținerea unor niveluri scăzute de DHA a creierului și a retinei la șobolanii hrăniți cu lapte n-3 Def. Dietele cu lapte de șobolan și granule artificiale au avut acizi grași n-3 foarte scăzute în cazul n-3 Def cu raporturi n-6/n-3 de 297 (Tabelul 1) și respectiv 815 (Tabelul 3). Raportul foarte ridicat a fost atins în ultimul caz datorită utilizării esterilor etilici ai acizilor grași purificați pentru furnizarea acizilor grași nesaturați. Acest tratament a avut succes în inducerea unei pierderi a DHA creierului. La vârsta de 15 săptămâni, șobolanii din grupul n-3 Def au prezentat o scădere cu 58% și 60% a DHA creierului, comparativ cu grupele n-3 Adq și, respectiv, cu lapte al barajelor [F(2,13) ​​= 286,000, p Figura 3

Teste comportamentale.

În testul de activitate motorie, nu au existat diferențe semnificative statistic în distanța de mișcare [F(2,32) = 2.250, p = 0,122] dintre cele trei grupuri (Fig. 4). Cu toate acestea, grupul n-3 Def a arătat un timp de mișcare semnificativ mai mare decât grupul crescut cu baraj [F(2,32) = 4,387, p Figura 4

Efectul deficitului de acid gras n-3 asupra (A) distanță de mișcare și (B) timpul de mișcare în testul de activitate motorie. Distanța de mișcare și timpul de mișcare sunt prezentate ca medie ± SEM, cu n = 11 sau 12. Diferențele dintre cele trei grupuri în timpul mișcării sunt semnificativ diferite într-o măsură repetată, ANOVA unidirecțională [F(2,32) = 4,387, p ○ n - 3 lapte Adq; ▾ Lapte de baraj.

În testul cu plus-labirint ridicat, cele trei grupuri au prezentat diferențe semnificative între d 1 și d 2 în timpul vizitei în brațul deschis [F(1,28) = 36,877, p Figura 5

În testul labirintului cu apă Morris, latența de evadare nu a fost diferită între grupurile dietetice din studiul vizibil [F(2,31) = 0,080, p = 0,923 (Tabelul 4)]. În studiul vizibil, 3 șobolani din 11 din grupul n-3 Def au ajuns la platformă, în timp ce 5 din 12 din grupul n-3 Adq și 5 din 11 din grupul crescut cu baraj au ajuns la platformă. În studiile de învățare, latența de evadare a grupelor de lapte n-3 Adq și baraje a scăzut treptat pe parcursul perioadei de testare (Fig. 6). Cu toate acestea, șobolanii n-3 Def au arătat o latență de evadare semnificativ mai mare decât în ​​n-3 Adq sau în grupul de lapte al barajelor [F(2,31) = 4.546, p Tabelul 4 Efectul deficitului de acizi grași n-3 asupra studiului vizibil în testul labirintului cu apă Morris

Efectul deficitului de acizi grași n-3 asupra latenței de evacuare în labirintul de apă Morris. Latența de evadare este prezentată ca medie ± SEM, cu n = 11 sau 12. Diferențele între trei grupuri („simbolul cercului negru” n-3 Lapte Def; „cercul alb” n-3 Lapte Adq; „triunghi negru inversat” Lapte Dam) sunt semnificativ diferite într-o măsură repetată, una- cale ANOVA [F(2,31) = 4.546, p ○ n - 3 lapte Adq; ▾ Lapte de baraj.

Valorile latenței de evadare au fost împărțite în timp de înot și odihnă. Timpii de odihnă în toate grupurile au fost similare și nu au existat diferențe semnificative [F(2,31) = 1.184, p = 0,320] între cele trei grupuri (Fig. 7). În cazul în care latența de evadare a fost crescută în grupul n-3 Def, timpul de înot a fost, de asemenea, semnificativ crescut [F(2,31) = 4.360, p Figura 7

Analiza fracționată a latenței de evadare în labirintul de apă Morris. Timpurile de înot (A) și odihnă (B) sunt prezentate ca medie ± SEM, cu n = 11 sau 12. Diferențele dintre timpul de înot între cele trei grupuri („simbolul cercului negru” n-3 Def Milk; „cercul alb” n-3 Adq Lapte; „triunghiul negru inversat” Lapte Dam) sunt semnificativ diferite într-o repetare măsuri, unidirecțional ANOVA [F(2,31) = 4.360, p ○ n - 3 lapte Adq; ▾ Lapte de baraj.

Efectul deficitului de acid gras n-3 asupra distanței și vitezei de înot. Distanța de înot (A) și viteza (B) sunt prezentate ca medie ± SEM, cu n = 11 sau 12. Diferențele de distanță de înot între cele trei grupuri („simbolul cercului negru” n-3 Lapte Def; „cercul alb” n-3 Lapte Adq; „triunghi negru inversat” Laptele barajului) sunt semnificativ diferite într-o repetare măsuri, unidirecțional ANOVA [F(2.31) = 6.205, p ○ n - 3 lapte Adq; ▾ Lapte de baraj.

În cadrul procesului de păstrare a memoriei, numărul traversărilor poziției platformei (regiunea A) a fost semnificativ mai mare decât cele din alte regiuni pentru grupele de lapte n-3 Adq și baraje [F(3, 44) = 6,021, p Figura 9

DISCUŢIE

Acest studiu demonstrează că puii născuți de baraje hrănite cu un aport relativ mare de LNA, o „dietă adecvată n-3”, în timpul gestației pot fi destul de deficiente în DHA creierului și retinian prin hrănirea unei diete foarte scăzute în acizi grași n-3 primele zile de viață până la maturitate. Este prezentat un model din prima generație care are mai multă relevanță pentru nutriția umană decât modelul cu două generații care este cel mai frecvent utilizat în acest domeniu. Atunci când creșterea creierului apare (54) în absența acizilor grași n-3 din dietă, lipsa aportului de DHA are ca rezultat o pierdere marcată de DHA creierului. Studii recente au arătat că majoritatea DHA creierului este furnizată de DHA preformat atunci când este disponibil în dietă (55). În acest studiu, biosinteza din LNA este o sursă nesemnificativă de DHA cerebral, deoarece a fost în mare parte eliminată din dietă (tabelele 1 și 3) și din circulație (56). La vârsta adultă (vârsta de 3 luni), DHA este înlocuit reciproc cu acidul gras 22-carbon n-6, DPAn-6. Cu toate acestea, se știe acum că există un decalaj în înlocuirea DHA cu DPAn-6 în primele câteva săptămâni de viață la șobolan (57), aparent din cauza ratei limitate de sinteză și transport a DPAn-6. la membrana neuronală în timpul neurogenezei foarte active.

Metoda de hrănire manuală utilizată aici, folosind sticlele care alăptează recent dezvoltate de Hoshiba (45), se îmbunătățește față de sistemele sale anterioare (43,44). În mâinile noastre, mortalitatea puilor a scăzut dramatic cu această nouă metodă, întrucât doar 1 pui a murit din 24 crescuți artificial în prezentul experiment. Acest pui a murit după aspirarea laptelui în plămâni. Există, de asemenea, o îmbunătățire a creșterii greutății corporale, puii AR ajungând la frații lor crescuți cu baraj cu aproximativ d 15 și la vârsta adultă depășind greutatea corporală crescută cu baraj. Din ultima observație, se pare că procedura AR poate fi indus o anumită diferență în ad libitum comportamentul alimentar. O scădere a balonării stomacale a fost, de asemenea, observată cu prezenta metodă, probabil datorită unei scăderi a aspirării aerului, deoarece sistemul actual folosește doar puterea de supt a puilor pentru a regla fluxul de lapte. Se folosesc sfarcuri mai mari care se potrivesc mai bine cu gurile puilor. De asemenea, trebuie remarcat faptul că acest sistem de hrănire poate fi utilizat pentru a manipula aportul oricărui nutrient alimentar al cărui nivel poate fi controlat în laptele artificial de șobolan.

Acest studiu demonstrează clar că înlocuirea DHA cu DPAn-6 duce la o pierdere a performanței comportamentale în sarcinile spațiale. Latența de evadare și retenția spațială, astfel cum a fost evaluată prin studiul sondei, au fost afectate la șobolanii cu deficit de acid gras n-3, în timp ce șobolanii hrăniți cu un lapte artificial de șobolan care conțin LNA, la fel de bine ca șobolanii crescuți cu baraj. Performanța comportamentală s-a corelat bine cu nivelul DHA din creier, întrucât atât grupurile n-3 Adq, cât și grupurile crescute cu baraj au avut niveluri similare de DHA creierului (interval 12-13%) și niveluri scăzute de DPAn-6 (aproximativ 0,4%), în timp ce grupul n-3 Def avea doar aproximativ 5% DHA cerebral și aproximativ 7% DPAn-6. În plus față de pierderea DHA, decalajul în înlocuirea DHA cu DPAn-6 în dezvoltarea timpurie (5-20 d postnatal) poate fi, de asemenea, un factor care duce la pierderi ale performanței comportamentale (57).

În rezumat, acest studiu a sugerat că hrănirea unei diete cu deficit de acid gras n-3 de la vârsta postnatală de la 2 la 15 săptămâni a indus o reducere cu 60% a DHA creierului și a produs un defect al funcției cerebrale legate de învățarea spațială. Comparativ cu țările asiatice, laptele matern al femeilor occidentale conține niveluri scăzute de acizi grași polinesaturați n-3 (65) și, până de curând, formulele de lapte occidental nu conțineau polinesaturați cu lanț lung (C20 sau C22), dar acizii grași esențiali erau furnizați preponderent de legume uleiuri bogate în acid linoleic (66,67). Este clar că compoziția acizilor grași din creierul și retina sugarului este influențată de obiceiurile alimentare ale mamei și că sugarii care primesc formule pe bază de ulei vegetal au o scădere a DHA creierului (68,69). Încă nu este clar dacă deficiențele mai moderate de acizi grași n-3 din populația umană adultă ar duce la o pierdere a DHA creierului.