A contribuit în mod egal la această lucrare cu: John H. Moore, Caio C. D. Pinheiro

nutrienți

Divizia de afiliere a bolilor infecțioase și a sănătății internaționale, Universitatea din Virginia, Charlottesville, Virginia, Statele Unite ale Americii

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: John H. Moore, Caio C. D. Pinheiro

Institutul de Biomedicină pentru Afiliere, Universitatea Federală Ceará, Fortaleza, Brazilia

Divizia de afiliere a bolilor infecțioase și a sănătății internaționale, Universitatea din Virginia, Charlottesville, Virginia, Statele Unite ale Americii

Divizia de afiliere a bolilor infecțioase și a sănătății internaționale, Universitatea din Virginia, Charlottesville, Virginia, Statele Unite ale Americii

Divizia de afiliere a bolilor infecțioase și a sănătății internaționale, Universitatea din Virginia, Charlottesville, Virginia, Statele Unite ale Americii

Divizia de afiliere a bolilor infecțioase și a sănătății internaționale, Universitatea din Virginia, Charlottesville, Virginia, Statele Unite ale Americii

Institutul de Biomedicină pentru Afiliere, Universitatea Federală din Ceará, Fortaleza, Brazilia

Institutul de Biomedicină pentru Afiliere, Universitatea Federală Ceará, Fortaleza, Brazilia

Institutul de Biomedicină pentru Afiliere, Universitatea Federală din Ceará, Fortaleza, Brazilia

Institutul de Biomedicină pentru Afiliere, Universitatea Federală Ceará, Fortaleza, Brazilia

Divizia de afiliere a bolilor infecțioase și a sănătății internaționale, Universitatea din Virginia, Charlottesville, Virginia, Statele Unite ale Americii

Divizia de afiliere a bolilor infecțioase și a sănătății internaționale, Universitatea din Virginia, Charlottesville, Virginia, Statele Unite ale Americii

  • John H. Moore,
  • Caio C. D. Pinheiro,
  • Edna I. Zaenker,
  • David T. Bolick,
  • Glynis L. Kolling,
  • Edward van Opstal,
  • Francisco J. D. Noronha,
  • Pedro H. Q. S. De Medeiros,
  • Raphael S. Rodriguez,
  • Aldo A. Lima

Corecţie

15 septembrie 2015: Moore JH, Pinheiro CCD, Zaenker EI, Bolick DT, Kolling GL și colab. (2015) Corecție: dietele nutritive definite modifică sensibilitatea la Clostridium difficile Boala asociată într-un model murin. PLOS ONE 10 (9): e0137037. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137037 Vizualizați corectarea

Cifre

Abstract

fundal

Clostridium difficile este o cauză majoră identificabilă și tratabilă a diareei asociate antibioticelor. Starea nutrițională slabă contribuie la mortalitate prin apărarea slabă a gazdei împotriva diferiților agenți patogeni. Scopul principal al acestui studiu a fost de a evalua contribuția unei diete proteice reduse la rezultatele infecției cu C. difficile într-un model murin.

Metode

Șoarecii C57BL/6 au fost hrăniți cu un chow de casă tradițional sau cu o dietă definită fie cu 20% proteină, fie cu 2% proteină și infectați cu tulpina C. difficile VPI10463. Animalele au fost monitorizate pentru severitatea bolii, vărsarea clostridială și nivelurile de toxină fecală. Microbiota intestinală selectată a fost măsurată în scaun și creșterea C. difficile și producția de toxine au fost cuantificate ex vivo în conținut intestinal de la șoareci netratați sau tratați cu antibiotice hrăniți cu diferite diete.

Rezultate

Șoarecii infectați cu C. difficile hrăniți cu diete definite, în special (și în mod neașteptat), cu diete cu deficit de proteine, au crescut supraviețuirea, au scăzut pierderea în greutate și au scăzut severitatea generală a bolii. Vărsarea de C. difficile și toxina în scaunul grupului cu diete tradiționale au fost crescute comparativ cu dieta definită la 1 zi după infectare. Șoarecii hrăniți cu dietă tradițională au avut un raport Firmicutes intestinal la Bacteroidetes crescut după expunerea la antibiotice, comparativ cu o dietă nutritivă definită cu 2% sau 20% proteine. Inocularea ex vivo a conținutului de cecal de la șoareci tratați cu antibiotice a arătat producția scăzută de toxine și creșterea C. difficile în ambele diete definite comparativ cu o dietă tradițională.

Concluzii

Dietele cu conținut scăzut de proteine ​​și dietele definite cu nutrienți în general s-au dovedit a fi protectoare împotriva CDI la șoareci. Modificările asociate induse de dietă ale microbiotei intestinale pot influența rezistența la colonizare și producția de toxină clostridială într-o dietă definită de nutrienți, comparativ cu o dietă tradițională, ducând la creșterea supraviețuirii. Cu toate acestea, mecanismele care duc la diferențe de supraviețuire între 2% și 20% dietele nutritive definite de proteine ​​trebuie să fie elucidate în continuare.

Citare: Moore JH, Pinheiro CCD, Zaenker EI, Bolick DT, Kolling GL, van Opstal E, și colab. (2015) Dietele nutritive definite modifică sensibilitatea la boala asociată cu Clostridium difficile într-un model murin. PLoS ONE 10 (7): e0131829. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0131829

Editor: Markus M. Heimesaat, Charité, Campus Benjamin Franklin, GERMANIA

Primit: 23 martie 2015; Admis: 6 iunie 2015; Publicat: 16 iulie 2015

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Finanțarea a fost asigurată de NIH/NIAID U01 AI075526 și de Fundația Bill & Melinda Gates APP16340. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Clostridium difficile este o bacterie anaerobă, formatoare de spori, gram-pozitivă [1] care provoacă boli în principal prin activitatea a două toxine, TcdA și TcdB. Unele tulpini de C. difficile produc o a treia toxină, toxina binară (CDT) sau C. difficile transferaza, care pot contribui la hipervirulență (cum ar fi tulpina Nap1/027) [2]. C. difficile este, de asemenea, recunoscut ca principalul agent cauzal identificabil și tratabil al diareei asociate antibioticelor [3]. Infecția cu C. difficile (CDI) are o gamă largă de clinici, de la transportul asimptomatic la diareea ușoară autolimitativă până la colita pseudomembranoasă severă (PMC) [4]. Odată cu apariția tulpinilor hipervirulente și utilizarea crescută a antibioticelor, incidența CDI a crescut dramatic în ultimii ani. Studiile efectuate în Canada, SUA și Europa raportează o creștere de două până la patru ori a incidenței CDI în ultimul deceniu [5, 6].

Expunerea la antibiotice este cel mai important factor de risc pentru dezvoltarea CDI [7]. Înainte de apariția agenților antimicrobieni, PMC a fost o boală relativ rară, în mare parte asociată cu operații colonice, pelvine sau gastrice [4]. Microbiota comensală inhibă colonizarea și creșterea excesivă a C. difficile și a altor agenți patogeni enterici [8, 9]. Compoziția modificată a microbiotei intestinale a fost observată la pacienții cu diaree asociată cu antibiotice [10]. În afară de utilizarea antibioticelor, există și alți factori de risc importanți asociați cu CDI, inclusiv: bătrânețe [7, 11], spitalizări frecvente și spitalizări prelungite [12, 13]. Efectul stării nutriționale asupra CDI nu a fost investigat.

Starea nutrițională slabă este bine recunoscută ca o problemă de sănătate răspândită, cu consecințe atât acute, cât și adesea pe termen lung. Malnutriția contribuie la mortalitate, direct sau indirect, prin mijloace de apărare slăbite împotriva altor boli precum malaria, boli respiratorii sau diareice [14]. S-a demonstrat că pentru unele infecții enterice, cum ar fi criptosporidioza, giardioza și E. coli enteroagregativă, o dietă cu deficit de proteine ​​are ca rezultat rezultate mai slabe din aceste boli în modelele murine de infecție enterică [15-17].

Dieta modifică microbiota intestinală la om [18]. Nutrienții specifici pot fi asociați cu modificări ale microbiotei intestinale care modifică severitatea inflamației intestinului (de exemplu, creșterea excesivă a Bilophilia wadsworthia din consumul excesiv de grăsimi saturate la șoarecii knockout IL-10 ducând la colită cronică mai gravă [19] care apare în mod normal în acest model animal), în timp ce probioticele (o combinație de Lactobacillus, Bifidobacterium și Streptococcus salivarius) poate ajuta la ameliorarea bolii inflamatorii intestinale la om [20]. Deoarece dieta modifică microbiota intestinală și starea nutrițională, inclusiv deficitul de proteine, afectează susceptibilitatea la infecția cu alte infecții enterice, am examinat modul în care o dietă subnutrită de proteine ​​poate modifica severitatea bolii într-un model murin de CDI și am examinat rolul unei diete proteice reduse. asupra microbiotei comensale selectate și sarcina infecției într-un model murin. În mod surprinzător, am găsit proteine, o dietă subnutrită de proteine ​​conferind protecție împotriva mortalității prin CDI, în timp ce o dietă tradițională a crescut mortalitatea în comparație cu dieta definită cu nutrienți, precum și creșterea asociată a sarcinii patogenilor și a modificărilor microbiotei.

Metode și materiale

Dietele șoarecilor

Modelul murin al infecției cu C. difficile

Testul toxinei A/B

Pentru a determina încărcarea cu toxine în scaun s-a utilizat un test C. DIFFICILE TOX A/B II (Techlab, Blacksburg, VA) și probele au fost prelucrate conform recomandărilor producătorului. Probele au fost normalizate în funcție de greutăți folosind diluantul furnizat în trusă. Probele au fost diluate de 10x și valorile densității optice (OD) au fost luate la 450/620 nm (citirile luate la 450 nm, acoperite cu aerul la 620 nm).

Analize de cuantificare bacteriene

Examinarea efectelor dietelor asupra microbiotei selectate la șoareci

Pentru a examina modificările microbiotei din diferite diete și antibiotice, șoarecii au fost plasați pe diferite diete (dieta tradițională Harlan (numărul de catalog 7912), dieta definită cu proteine ​​Harlan 2% (TD.08679), dieta definită cu proteine ​​Harlan 20% (TD.08678) ) timp de 19 zile. De asemenea, grupurilor selectate li s-au administrat antibiotice la 14 zile după începerea dietei, după cum este descris în studiile de inoculare ex vivo (Fig. 1B). După 19 zile, șoarecii au fost eutanasiați și atât conținutul de colon, cecum, cât și țesutul au fost colectate pentru extracția ADN și qPCR, așa cum este descris în secțiunea Analize de cuantificare bacteriană. Secțiunile de țesut de colon și cecum au fost spălate în soluție salină tamponată cu fosfat pentru a îndepărta orice conținut aderat înainte de o analiză suplimentară.

Model murin de rezistență la colonizare la C. difficile

Acest model publicat [28] a fost modificat pentru acest studiu. Șoarecilor li s-au administrat diete respective și s-au pretratat cu antibiotice așa cum s-a descris mai sus. După tratamentul cu antibiotice (Fig. 1B), șoarecii au fost eutanasiați și conținutul de cecal a fost colectat și depozitat la -20 ° C până la procesare. În condiții anaerobe, conținutul de cecal a fost diluat de trei ori în soluție salină sterilă tamponată cu fosfat (PBS) sterilă, inoculată cu 10 4 CFU C. difficile tulpina VPI 10463 și incubată timp de 24 de ore. Nivelurile de clostridie și toxine au fost măsurate prin PCR și, respectiv, ELISA, așa cum s-a descris mai sus.

metode statistice

Analizele statistice au fost efectuate folosind GraphPad Prism versiunea 5.0 (software GraphPad, San Diego, CA). Datele au fost prezentate ca eroare medie +/- standard a mediei (SEM). Semnificația în toate cazurile a fost stabilită la p≤0,05. Datele de supraviețuire au fost analizate prin analiza supraviețuirii Log-rank (Mantel-Cox). Scorurile, greutățile și valorile testului au fost analizate utilizând un test de analiză a varianței unidirecțională, bidirecțională sau repetată (ANOVA) sau testul t cu două cozi al elevului, după caz. O corecție Bonferroni post-test a fost utilizată împreună cu rezultate semnificative ANOVA pentru a determina unde se situează diferențe semnificative între grupuri. Cu teste de cuantificare bacteriene, valorile log 10 ale rezultatelor au fost utilizate pentru a obține o distribuție normală.

Rezultate

O dietă cu deficit de proteine ​​sau o dietă definită este protectoare împotriva infecției severe cu C. difficile

Șoarecii au luat dietele indicate începând cu 12-14 zile înainte și 14 zile după infecție cu tulpina C. difficile VPI 10463.A: Rata de supraviețuire. Testele Log-Rank au confirmat diferențe semnificative între dieta tradițională și fiecare dintre dietele de proteine ​​de 20% și 2% (p Fig. 3. Cuantificarea filamentelor microbiote intestinale rezidente Firmicutes, Bacteroidetes și Enterobacteriaceae și bacteriile totale utilizând qPCR.

Conținutul intestinal a fost preluat de la șoareci hrăniți fie cu o dietă tradițională, definită cu 20%, fie definită cu 2%, după cum este subliniat în Fig. 1B. Șoarecii hrăniți cu diete indicate au fost tratați cu și fără antibiotice. N = 3 animale pe grup, cu fiecare probă rulată în duplicat și rezultatele normalizate la 10 μg de probă. Bacteroidetes a fost semnificativ mai mare în conținutul de cecal al șoarecilor care au primit o dietă definită cu 2% sau 20% comparativ cu dieta tradițională (p Fig 4. Raportul Firmicutes la Bacteroidetes.

Raportul Firmicutes la Bacteroidetes în conținutul de colon (lumen) a fost semnificativ mai mare (ANOVA p = 0,0021, post-teste ambele p Fig 5. Inocularea ex vivo a conținutului Cecum cu C. difficile.

A. Nivelurile de toxină C. difficile (Toxină A/B ELISA) în conținut cecal 24 de ore după inoculare cu 10 4 VPI 10463 (N = 3 pentru fiecare grup). ANOVA într-un singur mod cu corectarea Bonferroni post-test nu a prezentat diferențe semnificative între grupuri B. PCR cantitativă în timp real a genei toxinei C. difficile, tcdB, în conținut cecal inoculat 24 de ore după inoculare (N = 3 pentru fiecare grup, rezultă în duplicat). A existat o creștere semnificativ mai mare a C. difficile în conținutul de cecal al dietei tradiționale cu antibiotice comparativ cu grupul de 20% cu antibiotice (inocul p 5 CFU. A, Rata de supraviețuire. B, Scorul clinic. C, Schimbarea greutății. D, Histopatologie Scoruri.