Departamentul de afiliere pentru patologie, Facultatea de Medicină a Universității Teikyo, Tokyo, Japonia

efecte

Departamentul de afiliere pentru patologie, Facultatea de Medicină a Universității Teikyo, Tokyo, Japonia

Departamentul de afiliere pentru patologie, Facultatea de Medicină a Universității Teikyo, Tokyo, Japonia

Departamentul de afiliere pentru patologie, Facultatea de Medicină a Universității Teikyo, Tokyo, Japonia

Departamentul de afiliere pentru patologie, Facultatea de Medicină a Universității Teikyo, Tokyo, Japonia

Departamentul de afiliere pentru patologie, Facultatea de Medicină a Universității Teikyo, Tokyo, Japonia

  • Yoshihisa Takahashi,
  • Yurie Soejima,
  • Arisa Kumagai,
  • Masato Watanabe,
  • Hiroshi Uozaki,
  • Toshio Fukusato

Cifre

Abstract

Citare: Takahashi Y, Soejima Y, Kumagai A, Watanabe M, Uozaki H, Fukusato T (2014) Efecte inhibitoare ale medicamentelor din plante japoneze Sho-saiko-to și Juzen-taiho-to asupra steatohepatitei nealcoolice la șoareci. PLoS ONE 9 (1): e87279. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0087279

Editor: Kalpana Ghoshal, Universitatea de Stat din Ohio, Statele Unite ale Americii

Primit: 23 iulie 2013; Admis: 19 decembrie 2013; Publicat: 22 ianuarie 2014

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de subvențiile Societății japoneze pentru promovarea științei (JSPS) pentru cercetarea științifică numărul 23790753 (URL: http://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/). Finanțatorul nu a avut nici un rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) este o afecțiune în care se acumulează grăsime excesivă în ficatul unui pacient care nu are antecedente de abuz de alcool. NAFLD este clasificat în 2 categorii: steatoza simplă, în care se observă numai steatoza și steatohepatita nealcoolică (NASH), în care, pe lângă steatoză, se observă inflamația lobulară și leziunea celulelor hepatice. NASH este o boală progresivă și se poate dezvolta în ciroză hepatică sau carcinom hepatocelular [1], [2]. NAFLD/NASH, considerat ca o manifestare hepatică a sindromului metabolic [3], [4], este în creștere la nivel mondial, împreună cu prevalența crescută a obezității și, în același timp, este cea mai frecventă boală hepatică cronică.

Ipotezele cu două lovituri [5] sau cu lovituri multiple [6] sunt, în general, susținute ca mecanisme care stau la baza patogeniei NAFLD/NASH. Se crede că acumularea de grăsime în ficat este necesară pentru apariția NAFLD, iar alte lovituri, cum ar fi stresul oxidativ, creșterea citokinelor inflamatorii sau scăderea citokinelor antiinflamatorii, sunt necesare pentru dezvoltarea bolii NASH progresive. Modelele animale sunt utile pentru elucidarea patogeniei și pentru dezvoltarea de noi tratamente pentru NASH. Deși au fost propuse mai multe modele genetice și nutriționale animale de NAFLD/NASH, aceste modele nu replică spectrul complet al caracteristicilor NAFLD/NASH uman [7]. Prin urmare, combinația a 2 sau mai mulți factori a fost utilizată ocazional ca model de combinație.

Scăderea în greutate prin modificarea stilului de viață este principalul tratament pentru NAFLD. Cu toate acestea, trebuie dezvoltată o terapie medicamentoasă pentru NAFLD, deoarece este adesea dificil pentru pacienții obezi să mențină modificări sănătoase ale stilului de viață. Medicamentele pe bază de plante japoneze (medicamente Kampo) sunt utilizate pe scară largă în Japonia și peste 80% dintre medicii japonezi prescriu în mod obișnuit aceste medicamente [8]. Întrucât se crede că JHM-urile posedă activități anti-oxidative și antiinflamatorii [9] - [11], acestea ar putea fi eficiente în tratamentul NASH. Cu toate acestea, până în prezent, doar 2 studii au examinat efectele JHM-urilor asupra NAFLD (adică, 1 studiu de bază asupra sho-saiko-to (TJ-9), keishi-bukuryo-gan (TJ-25) și oren-gedoku- to (TJ-15) [12] și 1 studiu clinic retrospectiv asupra TJ-25 [13]). Cu toate acestea, analizele patologice și moleculare ale țesuturilor hepatice nu sunt complete.

În studiul de față, pentru a examina efectele a 4 JHM [TJ-9, inchin-ko-to (TJ-135), juzen-taiho-to (TJ-48) și TJ-25] asupra NASH, am folosit un model combinat în care șoarecii db/db au fost hrăniți cu o dietă cu deficiență de metionină și colină (MCD). Mai mult, pentru a determina mecanismul care stă la baza acțiunilor JHM-urilor, am examinat nivelurile de expresie ale diferitelor gene ale citokinelor și ale receptorilor și nivelurile unui marker al stresului oxidativ din ficat. Am observat că TJ-9 și TJ-48 au inhibat leziunile hepatice ale modelului animal, deși mecanismele nu au fost complet elucidate.

Materiale și metode

Declarație de etică

Acest studiu a fost realizat în strictă conformitate cu recomandările din Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator de la Institutele Naționale de Sănătate. Protocolul a fost aprobat de Comitetul de Etică al Universității Teikyo (11-015). Toate animalele au primit îngrijire umană și s-au depus toate eforturile pentru a reduce la minimum suferința.

Medicamente

TJ-9, TJ-135, TJ-48 și TJ-25 au fost donate cu amabilitate de către Tsumura & Co. (Tokyo, Japonia). Aceste medicamente conțin extracte brute de ierburi. Compoziția fiecărui medicament este rezumată în Tabelul 1. Profilele tridimensionale de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) ale acestor medicamente au fost furnizate și de la Tsumura & Co. ca date suplimentare ale produselor.

Animale și protocoale experimentale

Treizeci și șase de șoareci BKS.Cg + Lepr db/+ Lepr db/J (db/db) de sex masculin au fost cumpărați de la Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japonia). După 1 săptămână de aclimatizare la mediu, șoarecii au fost împărțiți în 6 grupuri (n = 6 pentru fiecare grup): grupuri martor, MCD, TJ-9, TJ-135, TJ-48 și TJ-25. Șoarecii din grupul de control au fost hrăniți cu o dietă de control (dieta CRF-1) (Oriental Yeast Co., Tokyo, Japonia) ad libitum. Șoarecii din grupul MCD au fost hrăniți cu o dietă MCD (F2MCD) (Oriental Yeast Co.) ad libitum. Șoarecii din grupurile TJ-9, TJ-135, TJ-48 și TJ-25 au fost hrăniți cu dieta MCD suplimentată cu 1,5% (g/g) TJ-9, TJ-135, TJ-48 și TJ- 25, respectiv, ad libitum. Fiecare JHM conținea doar o cantitate mică de metionină și colină, iar conținutul de metionină și colină din dieta fiecărui grup JHM era de doar aproximativ 1% comparativ cu cel al grupului martor [14] - [16]. Astfel, este puțin probabil ca metionina și colina conținute în fiecare JHM să aibă un efect major asupra rezultatelor prezentului studiu. Dietele au fost depozitate la frigider la 4 ° C; recipientele pentru furaje pentru șoareci au fost reumplute cu dietă proaspătă de 3 ori pe săptămână, iar consumul de alimente a fost înregistrat. Șoarecii au fost menținuți în Centrul pentru animale de laborator al Școlii de Medicină a Universității Teikyo la 25 ° C și 45% umiditate.

Șoarecii au fost sacrificați prin decapitare după 4 săptămâni (la vârsta de 13 săptămâni). Șoarecii au murit de foame timp de 16 ore, iar greutățile corporale au fost măsurate înainte de a fi ucise. Probele de sânge ale fiecărui șoarece au fost colectate la decapitare, iar serul a fost separat prin centrifugare. Ficatul fiecărui șoarece a fost excizat și cântărit și au fost colectate probe pentru analiza histologică, purificarea ARN și congelarea rapidă.

Analiza biochimică a serului

Aspartatul aminotransferazei serice (AST), alanina aminotransferazei (ALT), colesterolului total (T-Cho), trigliceridelor (TG) și nivelurilor de glucoză au fost determinate prin metode de rutină folosind autoanalizatorul Hitachi 7180 (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Japonia) . Nivelurile serice de insulină, leptină și adiponectină au fost măsurate prin test imunosorbent legat de enzime (ELISA) utilizând trusa de măsurare a insulinei ultrasensibile la șoarece (Institutul Morinaga de Științe Biologice, Inc., Yokohama, Japonia), trusa leptină-șoarece (Shibayagi Co., Ltd, Shibukawa, Japonia) și kitul ELISA pentru adiponectină de șoarece/șobolan (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japonia), respectiv.

Analiza histologică

Părțile centrale ale celor 2 lobi hepatici mari au fost fixate în soluție de formaldehidă 10% și prelucrate în mod obișnuit pentru microscopie cu lumină. Colorarea roșie Sirius a fost efectuată pe lângă colorarea hematoxilinei și eozinei pentru a evalua fibroza hepatică. Caracteristicile histopatologice ale steatohepatitei au fost evaluate semi-cantitativ, în conformitate cu sistemul de notare histologic validat de Kleiner și colab. [17]. Gradul de steatoză a fost evaluat prin procentul de hepatocite care conțin grăsimi macro sau micro-veziculare și au fost clasificate după cum urmează: gradul 0 (33-66%) și gradul 3 (> 66%). Inflamația lobulară a fost clasificată ca: 0 (fără focare), 1 (4 focare pe 200 × câmp). Balonarea hepatocelulară a fost clasificată după cum urmează: 0 (niciunul), 1 (câteva celule cu balon) sau 2 (multe celule/balonare proeminentă). Scorul de activitate NAFLD (NAS) a fost calculat ca suma scorurilor de steatoză (0-3), inflamație lobulară (0-3) sau balonare hepatocelulară (0-2). Stadializarea fibrozei a fost clasificată după cum urmează: 0 (niciunul), 1 (perisinusoidal sau periportal), 2 (perisinusoidal și portal/periportal), 3 (fibroză de punte) sau 4 (ciroză).

Colorarea imunohistochimică și analiza morfometrică a imaginii

Colorarea imunohistochimică pentru actina musculară α-netedă (SMA) a fost efectuată pentru a detecta celulele stelate hepatice activate (HSC). Secțiunile de parafină ale specimenelor de ficat au fost imunomarcate cu anticorp monoclonal anti-SMA (clonă: 1A4, diluție: 1: 100, DakoCytomation, Glostrup, Danemarca) utilizând sistemul EnVision ™ FLEX (DakoCytomation). Recuperarea antigenului a fost efectuată prin încălzire timp de 20 min în tampon citrat la pH 6,0 într-o baie de apă.

Analiza imaginii a fost efectuată pentru a evalua obiectiv gradul de fibroză și numărul de HSC activate. Fotomicrografii a 3 câmpuri intralobulare selectate aleatoriu de 400 × au fost luate pentru fiecare diapozitiv Sirius roșu și colorare SMA. Frecvențele zonelor pozitive Sirius roșu sau SMA din aceste microfotografii au fost analizate cu software-ul de analiză a imaginii WinROOF (Mitani Corporation, Fukui, Japonia).

Reacție în lanț în timp real cu transcripție inversă a polimerazei (RT-PCR)

ARN-ul total a fost izolat din ficat folosind kitul AllPrep ADN/ARN/Protein Mini (Qiagen, Valencia, CA, SUA) și transcris invers utilizând kitul QuantiTect Reverse Transcription (Qiagen). Calitatea și cantitatea probelor de ARN au fost determinate folosind bioanalizorul Agilent 2100 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germania). PCR cantitativă în timp real a fost efectuată utilizând sistemul de PCR în timp real ABI 7300 și kitul Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies, Carlsbad, CA, SUA). Primerii pentru amplificarea complementară a ADN-ului factorului de necroză tumorală (TNF) -α, interleukinei (IL) -6, receptorului activat al proliferatorilor de peroxizomi (PPAR) α, PPARγ, factorului de creștere transformant (TGF) -β1 și genelor β-actinei sunt enumerate în Tabelul 2. β-Actina a fost utilizată ca control intern. Toate probele au fost analizate în trei exemplare. Cuantificarea absolută a numărului de copii a fiecărei gene a fost efectuată utilizând o curbă standard construită cu plasmide martor diluate în serie obținute prin donarea TA din produsele PCR ale țesuturilor hepatice ale șoarecilor din grupul martor. Nivelul de expresie al ARNm al fiecărei gene a fost normalizat de nivelul de expresie al ARNm al β-actinei.

Nivelurile de malondialdehidă (MDA) în ficat

Pentru a evalua leziunile oxidative ale lipidelor din ficat, nivelul hepatic de MDA a fost măsurat folosind kitul de testare MDA (Institutul Japonez pentru Controlul Îmbătrânirii, Fukuroi, Japonia), conform instrucțiunilor producătorului.

Analize statistice

Datele au fost indicate ca medie ± deviație standard. Analiza unică a varianței (ANOVA) a fost efectuată pentru a evalua semnificația diferențelor. P Tabelul 3. Date biochimice ale serului în grupuri experimentale.

Constatări histologice

Șoarecii din grupul MCD prezintă steatoză hepatică marcată (A), dar steatoza este suprimată la șoarecii din grupul TJ-48 (B). Focii necroinflamatori (săgeți) sunt împrăștiați în ficatul șoarecilor din grupul MCD (C), dar inflamația lobulară este suprimată la șoarecii din grupul TJ-9 (D). (Pata de hematoxilină și eozină; A și B: × 100; C și D: × 200).

Colorarea imunohistochimică și analiza morfometrică a fibrozei și HSC activate

Frecvența zonei Sirius roșu-pozitiv, reflectând gradul de fibroză, în lobulii hepatici a fost semnificativ mai mare în grupul MCD decât în ​​grupul de control și semnificativ mai mică în toate grupurile JHM (în special în grupul TJ-48) decât în grupul MCD (Figura 2A-C). Șoarecii din lotul martor au prezentat o ușoară pozitivitate roșie Sirius perisinusoidală. Rata zonei SMA-pozitive, care reflectă numărul de HSC activate, în lobulii hepatici a fost semnificativ mai mare în grupul MCD decât în ​​grupul de control și semnificativ mai mică în grupurile TJ-9, TJ-48 și TJ-25 (în special în grupul TJ-9) decât în ​​grupul MCD (Figura 2D - F).

(A-C) Frecvența zonei Sirius roșu-pozitiv este semnificativ mai mare în grupul MCD decât în ​​grupul de control și semnificativ mai mică în toate grupurile JHM decât în ​​grupul MCD. Zona Sirius roșu pozitivă este foarte mică în grupul de control. (A: fotomicrografie a unui șoarece din grupul MCD, B: fotomicrografie a unui șoarece din grupul TJ-48, × 400) (D - F) Rata zonei pozitive SMA este semnificativ mai mare în grupul MCD decât în grupul de control și semnificativ mai scăzut în grupurile TJ-9, TJ-48 și TJ-25 decât în ​​grupul MCD. (D: fotomicrografie a unui șoarece din grupul MCD, E: fotomicrografie a unui șoarece din grupul TJ-9, × 400). a Semnificativ diferit de grupul martor (P b Semnificativ diferit de grupul MCD (P Figura 3. Nivelurile de expresie ale citokinelor și ale genelor receptorilor din ficat.

Nivelurile de expresie TNF-α sunt mai mici în grupurile TJ-48 și TJ-25 decât în ​​grupul MCD (A). Nivelurile de expresie IL-6 sunt semnificativ mai mari în grupul MCD decât în ​​grupul de control; sunt mai mici în grupurile TJ-9, TJ-135 și TJ-48 decât în ​​grupul MCD, iar diferența este semnificativă statistic pentru grupul TJ-135 (B). Deși nivelurile de expresie PPARα sunt semnificativ mai mici în grupul MCD decât în ​​grupul martor, ele nu sunt influențate de suplimentarea cu JHM (C). Nivelurile de expresie PPARγ sunt semnificativ mai mici în grupul MCD decât în ​​grupul martor; sunt mai mari în toate grupurile JHM (în special în grupul TJ-9) decât în ​​grupul MCD (D). Nivelurile de expresie TGF-β1 sunt semnificativ mai mari în grupul MCD decât în ​​grupul de control și semnificativ mai mici în grupurile TJ-48 și TJ-25 decât în ​​grupul MCD (E). a Semnificativ diferit de grupul martor (P b Semnificativ diferit de grupul MCD (P Figura 4. Nivelurile MDA în ficat.