Kazuhiko Takahashi, Hiroaki Suwa, Tomoo Ishikawa și Hidehito Kotani

Genomică funcțională, Institutul de cercetare Banyu Tsukuba în colaborare cu Merck Research Laboratories, Tsukuba, Ibaraki, Japonia

receptorilor

Adresă corespondență către: Hidehito Kotani, Institutul de Cercetare Banyu Tsukuba, Okubu 3, Tsukuba, Ibaraki, 300-2611, Japonia. Telefon: 298-77-2202; Fax: 298-77-2027; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Takahashi, K. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Genomică funcțională, Institutul de cercetare Banyu Tsukuba în colaborare cu Merck Research Laboratories, Tsukuba, Ibaraki, Japonia

Adresă corespondență către: Hidehito Kotani, Institutul de Cercetare Banyu Tsukuba, Okubu 3, Tsukuba, Ibaraki, 300-2611, Japonia. Telefon: 298-77-2202; Fax: 298-77-2027; E-mail: [email protected].

Genomică funcțională, Institutul de cercetare Banyu Tsukuba în colaborare cu Merck Research Laboratories, Tsukuba, Ibaraki, Japonia

Adresă corespondență către: Hidehito Kotani, Institutul de Cercetare Banyu Tsukuba, Okubu 3, Tsukuba, Ibaraki, 300-2611, Japonia. Telefon: 298-77-2202; Fax: 298-77-2027; E-mail: [email protected].

Găsiți articole de Ishikawa, T. în: JCI | PubMed | Google Scholar

Genomică funcțională, Institutul de cercetare Banyu Tsukuba în colaborare cu Merck Research Laboratories, Tsukuba, Ibaraki, Japonia

Adresă corespondență către: Hidehito Kotani, Institutul de Cercetare Banyu Tsukuba, Okubu 3, Tsukuba, Ibaraki, 300-2611, Japonia. Telefon: 298-77-2202; Fax: 298-77-2027; E-mail: [email protected].

Publicat la 15 decembrie 2002 - Mai multe informații

Histamina este o substanță bioactivă puternică care a fost studiată de aproape un secol. Histamina este stocată în mastocitele țesuturilor periferice, iar eliberarea histaminei a fost implicată în patogeneza diferitelor reacții inflamatorii (1 - 3). De asemenea, histamina este un neurotransmițător aminergic localizat în SNC și sistemul nervos periferic. Neuronii histaminergici sunt localizați exclusiv în nucleul tuberomamilar (TM) al hipotalamusului posterior și își proiectează axonii în regiuni cerebrale, inclusiv hipotalamusul, talamusul, cortexul cerebral, amigdala și septul (4 - 7).

Analiza genotipării Southern blot. Am folosit fragmente 865-bp și 965-bp situate în afara vectorului de țintire pe partea 5 'și 3' ca probe pentru a examina clonele de celule ES direcționate corect și șoarecii mutanți ulteriori. Întreruperea țintită a secvenței de codificare a receptorului H3 cu caseta de rezistență PGK-neo a introdus un site BamHI suplimentar. În consecință, sondele de 5 ′ și 3 ′ au detectat fragmente BamHI de aproximativ 12 kb și respectiv 8,5 kb din celule ES care conțin alela receptorului H3 țintit.

Analiza compoziției corpului. Masa grasă și masa corporală slabă au fost măsurate așa cum s-a descris anterior (33); Șoareci femele de 20 până la 25 de săptămâni și femele de 16 până la 17 săptămâni (n = 3 sau 4) au fost utilizate.

Analiza expresiei H1, H2 și H3. Analiza Northern blot a fost efectuată folosind 4 μg de ARN total al creierului pentru H3 și 4 μg de ARNm cerebral pentru hibridizările H1 și H2. Sonda de hibridizare a constat din ADNc H3 de șoarece (poziții 432–1116), ADNc H1 uman (poziții 190–977), ADNc H2 uman (poziții 231–1026) și GAPDH uman (poziții 586–1037).

Analiza expresiei UCP1, UCP2 și UCP3. ARN-ul total a fost izolat din țesutul adipos maro (BAT), țesutul adipos alb (WAT) și mușchiul scheletic. Cinci micrograme de ARN total au fost analizate prin Northern blot. Sondele de hibridizare au constat din cADN-ul UCP1 de șoarece (pozițiile 745-11005), cADN-ul UCP2 de șoarece (pozițiile 870-1177) și cADN-ul UCP3 de șoarece (pozițiile 212-542). Măsurătorile densitometriei au fost efectuate de FUJIX BAS2000 (film Fuji, Tokyo, Japonia) și normalizate de GAPDH.

Măsurarea activității locomotorii. Am evaluat activitatea locomotorie a șoarecilor femele găzduite individual de 16 până la 21 de săptămâni (n = 9-11) cu un sistem fotobeam cu suport de colivie (15 × 25 × 12 cm) (Neuroscience, Tokyo, Japonia). Toate măsurătorile au fost luate timp de 4 zile în fiecare grup. Măsurătorile efectuate în ultimele 3 zile au fost utilizate pentru analiza datelor.

Analiza sângelui. Pentru testele de toleranță la glucoză, șoareci femele în vârstă de 26 până la 28 de săptămâni (n = 4-6) au fost postite 14 ore și li s-a administrat glucoză (2 g/kg) prin injecție intraperitoneală. Pentru testul de toleranță la insulină, insulina umană (0,75 U/kg; Novo Nordisk, Bagsværd, Danemarca) a fost administrată intraperitoneal la șoareci femele în vârstă de 26 până la 28 de săptămânin = 4-6) care a fost postit timp de 3 ore. Sângele a fost retras din coadă la momentele indicate. Nivelurile de glucoză din sânge au fost măsurate de AntsenseII (Daikin, Osaka, Japonia). Nivelurile plasmatice de leptină și insulină au fost măsurate prin ELISA (Morinaga, Yokohama, Japonia). Kituri comerciale de radioimunologie au fost utilizate pentru a măsura nivelurile de T4 fără plasmă (Dainabot, Tokyo, Japonia). Testele colorimetrice au fost utilizate pentru măsurarea colesterolului, triacilglicerinei (TG; KYOWA, Tokyo, Japonia) și a FFA (Wako, Tokyo, Japonia). Vârstele animalelor la testare au fost următoarele (pentru șoareci masculi și, respectiv, femele): pentru leptină, insulină și T4, 11-18 și 13-16 săptămâni; pentru FFA și colesterol, 11-20 și 13-16 săptămâni; pentru TG, 14-19 și 17-24 săptămâni; iar pentru glucoză, 8-12 și 13-16 săptămâni.

Măsurători ale histaminei/tele-metilhistaminei. Șoarecii au fost decapitați fără injecție pargilină, iar creierul lor a fost îndepărtat rapid, plasat pe gheață și împărțit în cinci regiuni: creierul anterior (inclusiv cortexul și striatul), hipocampul, hipotalamusul/talamusul, trunchiul cerebral și cerebelul. Probele de creier au fost cântărite și omogenizate în 10 vol de acid percloric 0,2 N cu un sonicator. Omogenatul a fost centrifugat la 10.000 g timp de 5 minute la 4 ° C. Supernatantul a fost neutralizat (la pH 7-8) cu tampon borat 1 M (pH 9,25). Șoareci femele cu vârsta cuprinsă între 20 și 26 de săptămâni (n = 3) au fost utilizate. Am măsurat histamina prin ELISA (Immunotech, Marsilia, Franța) și vițel-metilhistamină de RIA (Pharmacia Diagnostics, Uppsala, Suedia).

Administrarea intracerebroventriculară de tioperamidă și leptină. Medicamentele au fost injectate în cerebroventricul lateral drept (0,5 mm posterior, 1,0 mm lateral și 3,0 mm ventral spre bregmă) așa cum s-a descris anterior (34). Tioperamida (Tocris Cookson), neuropeptida Y (NPY; Peptide Institute, Osaka, Japonia) și leptina (Genzyme Techne, Minneapolis, Minnesota, SUA) au fost proaspăt dizolvate în soluție salină și infuzate la doze de 100 nmol, 2 μg și 0,5 μg per mouse, respectiv. Aportul alimentar a fost măsurat timp de 2 ore (tioperamidă și NPY) și 24 de ore (leptină) după perfuzie. Volumul perfuziei intracerebroventriculare a reactivilor a fost limitat la un volum total de 5,0 μl. Șoarecii utilizați pentru aceste experimente au fost șoareci masculi în vârstă de 20 până la 30 de săptămâni (n = 9) pentru tioperamidă și NPY și șoareci masculi de 18 până la 34 de săptămâni (n = 5) pentru leptină.

Administrarea intraperitoneală de tioperamidă. Tioperamida (10 mg/kg) și pargyline (65 mg/kg; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, SUA) au fost injectate intraperitoneal la șoareci femele (vârsta de 37-54 săptămâni, n = 4) pe un program de hrănire ad libitum. Creierul lor a fost îndepărtat rapid la 90 de minute după injectare. Întregul creier a fost folosit pentru vițel-testul metilhistaminei.

Întreruperea genei receptorului H3. Folosind un vector de direcționare care a inclus primul exon al genei H3 și recombinarea omoloagă, regiunea de codificare a receptorului H3 a fost înlocuită cu o casetă de rezistență la neomicină în celulele ES. Acest eveniment de direcționare a dus la ștergerea inițierii codonului Met și a aproximativ 20% din regiunea de codificare, care a inclus două regiuni care se întind pe transmembrană ale receptorului H3 cuplat cu proteina G. Analiza Southern Blotting a celulelor ES a arătat că gena neomicinei a fost inserată în gena H3, ceea ce a fost indicat printr-o modificare prevăzută în harta enzimei de restricție (Figura 1a). Celulele H3 +/– ES țintite au fost injectate în blastocisti care au produs șoareci himerici și descendenți H3 +/- heterozigoți. Analiza Southern blotting a confirmat că șoarecii H3 +/– au fost crescuți pentru a crea șoareci H3 -/- (Figura 1b), iar șoarecii s-au născut la frecvențele mendeliene așteptate (H3 +/+, 119] [28,9%]; H3 +/-, 200 [48,7%]; H3 -/- .92 (22,4%); total, 411 șoareci). Șoarecii H3 -/- și H3 +/– au fost viabile și fertili, iar o examinare grosieră a creierului și a altor organe a arătat că șoarecii H3 -/- nu prezentau anomalii evidente. Șoarecii heterozigoți knock-out H3 au fost încrucișați în fundalul C57BL/6 timp de patru generații.

(A) Întreruperea vizată a H3 alela la șoareci. Soarecele H3 sunt prezentate gena, constructul de țintire și alela așteptată. Fiecare dintre cei trei exoni este indicat prin cutii negre. Săgețile orizontale arată dimensiunea fragmentelor așteptate după digestia BamHI. Sunt prezentate două sonde care au fost utilizate în analiza Southern blot. B, BamHI; S, SmaI; Xb, XbaI. (b) Analiza Southern blot a ADN-ului genomic din coada șoarecelui și hibridizarea după digestia ADN-ului cu BamHI folosind sonda 1 din (A). +/+, H3 +/+; +/–, H3 +/–; -/-, H3 -/-. (c) Analiza Northern blot a ARN-ului total al creierului. Sonda H3 exon 3 a fost utilizată în acest experiment, iar GAPDH a fost utilizat ca control intern. (d) Test de legare agonistă a membranelor cerebrale cu [3 H] NAMHA. Datele sunt reprezentative pentru trei experimente. Șoarecii H3 +/+ sunt indicați prin pătrate și H3 -/- șoarecii prin triunghiuri. (e) Analiza Northern blot a ARNm cerebral. Au fost utilizate sonde specifice H1 și H2, iar GAPDH a servit drept control intern.

Analiza Northern blotting a ARN-ului total al creierului de la șoareci H3 -/- nu a afișat un semnal detectabil de ARNm H3, iar nivelurile de ARNm H3 la șoareci H3 +/– au fost mai mici decât cele de la șoareci H3 +/+ (Figura 1c). Studiile de legare cu agonistul selectiv H3 NAMHA au confirmat absența receptorilor funcționali H3 în fracțiunile membranei cerebrale și au demonstrat că creierul șoarecilor H3 -/- nu avea receptori funcționali H3 (Figura 1d). Pentru a exclude posibilitatea unor schimbări compensatorii de dezvoltare în expresia altor receptori de histamină, abundența de ARNm H1 și H2 în creier a fost determinată prin analiza Northern blot (Figura 1e). Nivelurile de ARNm H1 și H2 la șoarecii H3 -/- au fost similare cu cele de la colegii H3 +/+.

(A) Curba de creștere a șoarecilor masculi H3 +/+ și H3 -/- (n = 9 sau 10, **P +Șoarecii/+ sunt indicați prin pătrate și H3 -/- șoarecii prin triunghiuri. (b) Curba de creștere a șoarecilor femele H3 +/+ și H3 -/- (n = 7 sau 8, **P +Șoarecii/+ sunt indicați prin pătrate și H3 -/- șoarecii prin triunghiuri. (c) Aportul alimentar al șoarecilor H3 +/+ și H3 -/-. Se arată consumul de alimente pe 24 de ore al șoarecilor de sex masculin în vârstă de 21 până la 26 de săptămâni și al șoarecilor femele de 19 până la 21 de săptămâni hrăniți ad libitum (n = 7-9, *P +Șoarecii/+ sunt indicați prin bare albe, iar șoarecii H3 -/- prin bare negre. (d) Curba de creștere și aportul zilnic de alimente de șoareci masculi H3 +/+ și H3 -/- (n = 12-16, *P +Șoarecii/+ sunt indicați prin pătrate și bare albe și H3 -/- șoareci prin triunghiuri și bare negre.

Nivelurile de histamină și metabolit cerebral

Modificări ale markerilor metabolici la șoareci H3 -/-. Pentru a investiga modificările metabolice la șoareci H3 -/- în detaliu, expresia mai multor gene care sunt asociate cu consumul de alimente și cheltuielile de energie au fost măsurate prin analiza Northern blotting (Figura 5a). La șoarecii obezi H3 -/-, expresia UCP1 și UCP3 în BAT, UCP3 în WAT și UCP3 în mușchiul scheletic a fost redus. Măsurătorile de densitometrie luate din Northern blotting au indicat mARN-ul UCP1 în BAT, mARN-ul UCP3 în BAT, mARN-ul UCP3 în WAT și mARN-ul UCP3 în mușchiul scheletic au fost reduse cu 78%, 77%, 52% și, respectiv, 64% în H3 -/- șoareci în comparație cu șoarecii martor H3 +/+. Temperatura miezului corpului a scăzut ușor, dar constant la șoarecii H3 -/- (n = 9 sau 10; 37,1 ° C ± 0,1 ° C la șoarecii H3 -/- și 37,5 ° C ± 0,1 ° C la șoarecii H3 +/+ în faza întunecată). Aceste modificări oferă o posibilă explicație mecanicistă pentru scăderea cheltuielilor de energie și creșterea greutății corporale care se observă la șoarecii homozigoti H3 -/-. Expresia peptidelor orexigenice NPY (37) și a hormonului de concentrare a melaninei (MCH) (38) nu s-a modificat (datele nu sunt prezentate).

Datele prezentate aici indică faptul că receptorii H3 sunt implicați în medierea reglării greutății corporale și modularea aportului alimentar și a cheltuielilor de energie la șoareci. Posibile mecanisme sunt autoreglarea neuronilor histaminergici și inhibarea eliberării histaminei sau efectele presinaptice heterologe asupra, de exemplu, a neuronilor serotoninergici. Biosinteza și eliberarea histaminei sunt reglate prin intermediul receptorilor H3, care se află pe membranele presinaptice. Agoniștii receptorilor H3, cum ar fi histamina, inhibă acest proces, în timp ce antagoniștii receptorilor H3 promovează eliberarea histaminei. Modularea tonusului histaminergic în SNC a fost implicată în mai multe modificări de comportament, inclusiv aportul de alimente și apă. Rezultatele noastre confirmă faptul că mecanismele de autoreglare H3 sunt importante pentru homeostazia greutății corporale. Cu toate acestea, implicarea altor sisteme neuronale în reglarea hrănirii, în special a sistemelor serotoninergice, nu poate fi abordată în acest studiu. Se știe că receptorii H3 se localizează pe alți terminali monoaminergici și funcționează ca heteroreceptori.

În concordanță cu o greutate corporală crescută, am observat o creștere a masei grase la șoarecii H3 -/-. Șoarecii H3 -/- au avut o creștere a greutății epididimului (ovarian pentru femeie), mezenteric, retroperitoneal WAT și BAT în comparație cu șoarecii H3 +/+; aceste modificări reflectă o creștere a masei grase la șoarecii H3 -/-. De asemenea, am observat un răspuns la doza genei H3 în unele fenotipuri de șoareci H3 +/–, care a inclus efecte asupra greutății adipoase și a greutății corporale. Creșterea masei grase la șoareci H3 -/- corelată cu o creștere a nivelului plasmatic de leptină și insulină, deoarece creșterea greutății adipoase este cauzată de creșterea secreției de leptină și insulină la rozătoare.

Un posibil mecanism care stă la baza acestor observații este reglarea afectată a neuronilor histaminergici. Prezența nivelurilor crescute de vițel-metilhistamina, care este un metabolit al histaminei, în toate zonele creierului ne-a confirmat ipoteza. Am emis ipoteza că lipsa autoreceptorilor, care are ca rezultat eliberarea continuă a histaminei de la neuronii presinaptici la șoarecii H3 -/-, împiedică încetarea eliberării histaminei care este cauzată în mod normal de expunerea la histamină. Eliberarea continuă de histamină poate suprasolicita aparatul de sinteză a histaminei și poate duce la o scurtare cronică a histaminei în capătul nervos. Reduceri ale nivelurilor de neurotransmițători și modificări ale ratei de rotație a acestora în perturbarea țintită a autoreceptorilor la șoareci au fost descrise anterior în șoarecii knockout (43) ai receptorilor α2A-adrenergici (43) și șoarecii 5-HT1B autoreceptor knockout (44).

Deoarece s-a dovedit că mai mulți antagoniști H3 măresc eliberarea de histamină și suprimă consumul de alimente (19 - 21, 26 - 30), crește concentrația de vițel-metilhistamina din regiunea hipotalamică a creierului șoarecilor H3 -/- cuplată cu aportul crescut de alimente au fost neașteptate. Relația dintre creșterea creierului vițel-concentrațiile de metilhistamină și aportul crescut de alimente ar putea fi explicate prin desensibilizarea receptorilor de histamină H1. Datorită eliberării cronice a histaminei, funcția receptorilor H1 ar putea fi reglată în jos pentru a compensa expunerea constitutivă la histamină. Am constatat că receptorii H1 au fost ușor reglementați în jos în regiunea hipotalamică a șoarecilor H3 -/- în comparație cu cei din controalele H3 +/+ littermate (n = 3; 228 ± 53,9 cpm la șoarecii H3 +/+ și 143 ± 30,9 cpm la șoarecii H3 -/- la [3 H] legarea pirilaminei în membrana hipotalamică). Aceste date ar putea implica faptul că reglarea descendentă a receptorilor H1 poate fi parțial responsabilă pentru aportul crescut de alimente. Cu toate acestea, sunt necesare mai multe studii pentru a aborda implicarea receptorilor H1 în reglarea apetitului mediată de histamină (45, 46).

Injecția intracerebroventriculară de tioperamidă la șoareci H3 -/- ne-a confirmat ipoteza că receptorii H3 reglează aportul alimentar prin modularea histaminei. Eliberarea histaminei nu a fost observată la șoarecii H3 -/- după administrarea tioperamidei, indicând faptul că tioperamida reglează eliberarea histaminei prin receptorii H3. De asemenea, activitățile anorexigenice ale tioperamidei la hiperfagia indusă de NPY nu au fost detectate la șoarecii H3 -/-; cu toate acestea, tioperamida a atenuat hiperfagia indusă de NPY la colegii de gunoi H3 +/+. Aceste rezultate implică faptul că activitățile anorexigenice ale tioperamidei sunt mediate prin receptorii H3 prin modularea tonusului histaminergic al creierului.

Din datele prezentate, deducem că inactivarea H3 la șoareci modifică reglarea greutății corporale, a cheltuielilor de energie și a consumului de alimente și duce la un șoarece hiperfagic obez cu cheltuieli de energie reduse și rezistență la insulină și leptină. Este de conceput ca manipularea farmacologică a receptorului H3 cu compuși selectivi să poată fi aplicată la tratamentul obezității la om.

Mulțumim lui M. Yoshida, L. Van der Ploeg, D. Marsh, A. Kanatani și S. Tokita pentru sprijin și comentarii cu privire la proiect; J. Winward și K. Marcopul pentru asistență editorială; H. Ohta, M. Maetani, S. Okuda, R. Yoshimoto și A. Ishihara pentru lucrări tehnice; și membrii grupului de genomică funcțională pentru discuțiile lor informative.

Conflict de interese: Autorii au declarat că nu există niciun conflict de interese.

Abrevieri non-standard utilizate: nucleu tuberomamilar (TM); nucleul ventromedial (VMH); nucleul arcuat (ARH); tulpina embrionară (ES); neomicină (neo); N-a-metilhistamină (NAMHA); degradare pe minut (dpm); țesut adipos maro (BAT); țesut adipos alb (WAT); triacilglicerol (TG); neuropeptida Y (NPY); histamina N-metiltransferază (HMT); hormon concentrator de melanină (MCH).