De la Institutul Național al Sănătății și al Căutării U771 (CB, EBdC, A.-LG, EV, AB, OD, AJ, LL, DH), Centrul Național al Cercetării Științifice UMR 6214, Université d'Angers, Angers, Franța; și Facultatea de Farmacie (C.B., P.M.), Universitatea din Montreal, Montreal Quebec, Canada.

De la Institutul Național al Sănătății și al Căutării U771 (CB, EBdC, A.-LG, EV, AB, OD, AJ, LL, DH), Centrul Național al Cercetării Științifice UMR 6214, Université d'Angers, Angers, Franța; și Facultatea de Farmacie (C.B., P.M.), Universitatea din Montreal, Montreal Quebec, Canada.

De la Institutul Național al Sănătății și al Căutării U771 (CB, EBdC, A.-LG, EV, AB, OD, AJ, LL, DH), Centrul Național al Cercetării Științifice UMR 6214, Université d'Angers, Angers, Franța; și Facultatea de Farmacie (C.B., P.M.), Universitatea din Montreal, Montreal Quebec, Canada.

De la Institutul Național al Sănătății și al Căutării U771 (CB, EBdC, A.-LG, EV, AB, OD, AJ, LL, DH), Centrul Național al Cercetării Științifice UMR 6214, Université d'Angers, Angers, Franța; și Facultatea de Farmacie (C.B., P.M.), Universitatea din Montreal, Montreal Quebec, Canada.

De la Institutul Național al Sănătății și al Căutării U771 (CB, EBdC, A.-LG, EV, AB, OD, AJ, LL, DH), Centrul Național al Cercetării Științifice UMR 6214, Université d'Angers, Angers, Franța; și Facultatea de Farmacie (C.B., P.M.), Universitatea din Montreal, Montreal Quebec, Canada.

De la Institutul Național al Sănătății și al Căutării U771 (CB, EBdC, A.-LG, EV, AB, OD, AJ, LL, DH), Centrul Național al Cercetării Științifice UMR 6214, Université d'Angers, Angers, Franța; și Facultatea de Farmacie (C.B., P.M.), Universitatea din Montreal, Montreal Quebec, Canada.

De la Institutul Național al Sănătății și al Căutării U771 (CB, EBdC, A.-LG, EV, AB, OD, AJ, LL, DH), Centrul Național al Cercetării Științifice UMR 6214, Université d'Angers, Angers, Franța; și Facultatea de Farmacie (C.B., P.M.), Universitatea din Montreal, Montreal Quebec, Canada.

De la Institutul Național al Sănătății și al Căutării U771 (CB, EBdC, A.-LG, EV, AB, OD, AJ, LL, DH), Centrul Național al Cercetării Științifice UMR 6214, Université d'Angers, Angers, Franța; și Facultatea de Farmacie (C.B., P.M.), Universitatea din Montreal, Montreal Quebec, Canada.

De la Institutul Național al Sănătății și al Căutării U771 (CB, EBdC, A.-LG, EV, AB, OD, AJ, LL, DH), Centrul Național al Cercetării Științifice UMR 6214, Université d'Angers, Angers, Franța; și Facultatea de Farmacie (C.B., P.M.), Universitatea din Montreal, Montreal Quebec, Canada.

De la Institutul Național al Sănătății și al Căutării U771 (CB, EBdC, A.-LG, EV, AB, OD, AJ, LL, DH), Centrul Național al Cercetării Științifice UMR 6214, Université d'Angers, Angers, Franța; și Facultatea de Farmacie (C.B., P.M.), Universitatea din Montreal, Montreal Quebec, Canada.

Vizualizați cea mai recentă versiune a acestui articol. Versiunile anterioare:

Abstract

Sindromul metabolic este o problemă comună de sănătate. Incidența și prevalența acesteia cresc în paralel cu prevalența și incidența sporite a obezității și a diabetului de tip 2. 1,2 Acest sindrom nu este doar o tulburare metabolică; este, de asemenea, asociat cu disfuncție endotelială 3 și remodelare vasculară ducând la o reducere a diametrului arterial. 4 Pacienții cu sindrom metabolic prezintă un risc crescut de mortalitate generală, precum și morbiditate și mortalitate cardiovasculară. 5

Practic, o creștere a tensiunii arteriale sau o scădere a fluxului sanguin induce o ajustare tranzitorie a diametrului vasului mediată de modificările tonusului miogen și de eliberarea de substanțe vasoactive. Pe de altă parte, creșterea fluxului sanguin induce o vasodilatație mediată de NO derivat din endoteliu. O expunere pe termen lung la forțe mecanice modificate induce remodelarea vasculară pentru a restabili tensiunile de forță și forfecare. 6.7 Creșterea pe termen lung a stresului de forfecare mărește producția de NO de către celulele endoteliale și am arătat anterior că NO are un rol cheie în remodelarea vasculară a arterelor mari 8 și de rezistență ca răspuns la un flux sanguin crescut. 9

Metode

Animale

Doisprezece șobolani Zucker obezi de sex masculin și martorii lor de șobolan (șobolani slabi Zuker), la vârsta de 10 săptămâni, au fost cumpărați de la Charles River (L’Arbresles, Franța). Șobolanii au fost anesteziați (pentobarbital de sodiu, 50 mg/kg, IP) și supuși unei intervenții chirurgicale pentru a modifica fluxul sanguin așa cum s-a descris anterior. 9 Pe scurt, au fost utilizate 3 artere consecutive de ordinul întâi. Ligaturile au fost aplicate pe ramuri de ordinul doi (Figura 1A). Artera situată între cele 2 artere ligate a fost concepută ca o arteră HF. Arterele situate la distanță de arterele ligate au fost utilizate ca control (NF).

remodelarea

figura 1. Modificări structurale ale arterelor de rezistență mezenterică HF și NF izolate de șobolani slabi și obezi. A, Reprezentare schematică a modelului utilizat pentru modificarea locală a fluxului sanguin în arterele mezenterice după ligarea arterială alternativă. B, Modificări ale diametrului pasiv ca răspuns la creșteri treptate ale presiunii. C, CSA a arterelor mezenterice la 75 mm Hg. Se prezintă media ± SEM (n = 12 per grup). *P

La șapte zile după operație, șobolanii au fost anesteziați (pentobarbital de sodiu, 50 mg/kg, IP) pentru măsurarea tensiunii arteriale. Au fost apoi eutanasiați prin inhalarea CO2, intestinul excizat și arterele mezenterice disecate. Din fiecare șobolan, arterele HF și NF au fost izolate și împărțite în mai multe segmente utilizate, respectiv (de la partea proximală la cea distală a arterei), pentru măsurarea diametrului și analize farmacologice, biochimice și imunohistologice.

Comitetul etic al universității a aprobat prezentul protocol. Procedura urmată în îngrijirea și eutanasierea animalelor de studiu a fost în conformitate cu Standardele Comunității Europene privind îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator (Ministère de l'Agriculture, Franța, autorizația nr. 6422).

Relația presiune - diametru și dilatarea mediată de debit în arterele NF și HF

Un prim segment de artere NF și HF, de 4 mm lungime și ≈300 μm ID, a fost canulat la ambele capete și montat într-un sistem de perfuzie monitorizat video 17 așa cum a fost descris anterior. 16 Pe scurt, dilatarea mediată de flux (FMD; trepte de la 3 la 100 μL/min) a fost determinată la o presiune de 75 mm Hg pe arterele preconstricte (fenilefrină; 1 μmol/L). După 30 de minute, FMD s-a repetat în prezența N Ester metilic al G-nitro-1-argininei (1-NUME; 100 μmol/L; 20 minute). În cele din urmă, după spălare, diametrul arterial pasiv a fost evaluat în absența tonusului muscular neted, adică în prezența EGTA (2 mmol/L) și nitroprusidă de sodiu (SNP; 0,1 mmol/L) și în absența calciului extracelular . 16

Pentru a determina aria secțiunii lor transversale (CSA), arterele au fost fixate cu formaldehidă sub o presiune de 75 mm Hg. CSA a fost determinat așa cum s-a descris anterior. 16

Profilul farmacologic al arterelor izolate NF și HF

Alte două segmente arteriale (2 mm lungime fiecare) au fost disecate și montate într-un miograf cu sârmă (DMT). Au fost efectuate 16 curbe cumulative de concentrație - răspuns la fenilefrină (0,01 până la 10 μmol/L) și SNP (0,001 până la 10 μmol/L). În alte segmente arteriale, s-au obținut 2 curbe de concentrație - răspuns la acetilcolină (ACh; 0,001 până la 10 μmol/L) înainte și după incubare cu unul dintre următorii agenți: l -NAME (100 μmol/L), cataloză mimolică Tempol 10 μmol/L), superoxid dismutază (120 U/mL) plus catalază (80 U/mL) sau tetrahidrobiopterină (10 μmol/L) plus 1-arginină (100 μmol/L). Dilatarea dependentă de SNP și ACh a fost efectuată în arterele precontractate cu fenilefrină la 50% din răspunsul lor contractil maxim.

Analiza Western Blot

Așa cum s-a descris anterior, 9 artere au fost omogenizate, iar proteinele (25 μg de proteină totală din fiecare probă) au fost separate prin SDS-PAGE folosind un gel de stivuire de 4% urmat de un gel de funcționare de 10%. Proteinele au fost detectate cu anticorpi specifici (laboratoare de transducție) împotriva NO sintetazei endoteliale (eNOS) 1: 1000, fosfo-eNOS 1: 500 și subunități ale fosfat oxidazei nicotinamid-adenin dinucleotid fosfat oxidază (gp91 phox și p67 phox) actina 1: 1000 în soluție salină tamponată cu Tris Tween 20). Expresia proteinelor a fost vizualizată utilizând kitul de chemiluminescență ECL-Plus (Amersham) și normalizată prin expresia actinei.

Detectarea anionilor superoxizi

Un alt segment arterial a fost încorporat vertical în Tissue-tek (Sakura) și înghețat în izopentan. Detectarea superoxidului a fost efectuată pe secțiuni transversale de 7-μm grosime incubate cu dihidroetidină (DHE), așa cum s-a descris anterior. 18 Colorarea pozitivă a fost vizualizată folosind microscopia confocală și software-ul QED-Image (Solamere Technology). Analiza imaginii a fost efectuată folosind Histolab (Microvision). Cuantificarea pixelilor a fost executată așa cum a fost descris anterior. 9 Un experiment de control pozitiv a fost efectuat folosind secțiuni de artă mezenterică tratate timp de 2 ore cu lipopolizaharidă in vitro la 37 ° C într-o soluție de sare fiziologică. Un control negativ a fost obținut prin omiterea DHE sau prin adăugarea de tempol la secțiune cu 15 minute înainte de DHE.

Analize statistice

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM. Semnificația diferenței dintre artere a fost determinată de ANOVA (ANOVA cu 1 factor sau ANOVA pentru măsurători consecutive pentru compararea curbelor concentrație - răspuns). Mijloacele au fost comparate prin asociere t test sau prin testul Bonferroni pentru comparații multigrup. Valorile P l -NAME (Figura 2B și 2C). Nivelul de expresie al eNOS a fost mai mare în HF decât în ​​arterele NF atât la șobolanii slabi, cât și la cei obezi (Figura 2D). Cu toate acestea, fosforilarea eNOS nu a fost semnificativ mai mare în IC decât în ​​arterele NF (Figura 2E). Raportul fosfo-eNOS/eNOS a fost redus semnificativ la șobolanii obezi comparativ cu șobolanii slabi din arterele NF și HF. În plus, a fost mai scăzută în arterele HF comparativ cu arterele NF la șobolanii obezi (Figura 2F).

Figura 2. Curba de răspuns cumulativ (CRC) la ACh (0,001 până la 10 μmol/L; A) în arterele de rezistență mezenterică HF și NF izolate de șobolani slabi și obezi. Inhibarea sintezei NO a fost efectuată folosind l -NAME la șobolanii slabi și obezi NF (B) și HF (C). Analiza Western blot a eNOS (D) și fosfo-eNOS (P-eNOS; E) a fost efectuată în arterele HF și NF la șobolanii slabi și obezi. Raportul (B) fosfo-eNOS/eNOS este prezentat în F. G, Blots tipice pentru eNOS și P-eNOS. Se prezintă media ± SEM (n = 12 per grup). *P

Formarea superoxidului, evaluată prin fluorescență sporită cu bromură de etidiu (Figura 3A), a fost semnificativ crescută în IC comparativ cu arterele NF. Mai mult, la șobolanii obezi, nivelurile de superoxid au fost semnificativ mai mari decât la șobolanii slabi din ambele artere HF și NF (Figura 3B). Experimentele de control pozitiv și negativ au confirmat că colorarea DHE este eficientă în secțiuni ale segmentelor arteriale (Figura S1, disponibilă la http://hyper.ahajournals.org). Nivelurile de expresie ale subunităților reduse de nicotinamidă-adenină dinucleotid fosfat oxidază gp91 phox și p67 phox au fost mai mari la obezii decât la șobolanii slabi atât în ​​arterele NF cât și în cele HF (Figura 3C și 3D). În plus, au fost mărite în toate arterele HF comparativ cu arterele NF.

Figura 3. Detectarea in situ a superoxidului în arterele mezenterice NF și HF de la șobolani slabi și obezi (A). Producția de superoxid în diferite grupuri este prezentată în graficele cu bare din B. Nivelurile de expresie ale subunităților reduse de nicotinamidă-adenină dinucleotid fosfat oxidază, gp91fox (C) și p67fox (D), au fost determinate folosind analiza Western blot (bloturile tipice sunt prezentate sub bara grafice). Incidența inhibiției producției de superoxid în dilatarea mediată de ACh a fost efectuată folosind Tempol (E), superoxid dismutază plus catalază (F), l-arginină plus tetrahidrobiopterină (G) sau Tempol în plus față de l -arginină plus tetrahidrobiopterină (H). Se prezintă media ± SEM (n = 12 per grup). *P

Relația dintre producția excesivă de specii reactive de oxigen (ROS) și disfuncția endotelială a fost confirmată folosind acut Tempol (Figura 3E) sau combinația de superoxid dismutază plus catalază (Figura 3F). În aceste condiții, dilatarea indusă de ACh nu mai era diferită între arterele HF și NF, precum și între șobolanii obezi și slabi (comparativ cu Figura 2A). În mod similar, combinația de l-arginină plus tetrahidrobiopterină a restabilit dilatația dependentă de endoteliu în arterele NF și HF obeze de șobolan la nivelul de control (arterele NF slabe; Figura 3G). Tempol, în plus față de l-arginină plus tetrahidrobiopterină, nu a avut niciun efect suplimentar asupra dilatației dependente de endoteliu decât l-arginină plus tetrahidrobiopterină numai (Figura 3H).

Contracția indusă de fenilefrină și KCl, precum și dilatarea indusă de SNP, au fost similare la șobolanii obezi și slabi. În mod similar, acestea nu au fost afectate în mod semnificativ de modificările cronice ale fluxului sanguin (Figura S2).

La șobolanii slabi, FMD a fost semnificativ mai mare în IC decât în ​​arterele NF. La șobolanii obezi, nu s-a observat nicio diferență în FMD între arterele NF și HF (Figura S3A). În ambele artere NF și HF, FMD a fost mai mică la obezi decât la șobolani slabi. l -NAME a redus FMD în ambele grupuri. La șobolanii slabi, atenuarea FMD cu l -NAME a fost semnificativ mai mare în HF decât în ​​arterele NF, în timp ce, la șobolanii obezi, atenuarea FMD cu l -NAME a fost similară în arterele NF și HF. Mai mult, în arterele HF și NF, efectul l -NAME a fost mai mic decât în ​​arterele corespunzătoare la șobolanii slabi (Figura S3B). Diametrul arterial înainte de dilatarea arterelor cu flux a fost similar în cele 4 grupe de artere (n = 12 per grup): 158 ± 26 μm (NF slab), 153 ± 26 μm (HF slab), 163 ± 21 μm (NF obez), și 161 ± 22 μm (suspensie HF).

Discuţie

Am constatat la șobolanii obezi Zucker că o creștere cronică a fluxului sanguin în arterele de rezistență a indus o mărire a diametrului asociată cu o capacitate vasorelaxantă redusă a endoteliului prin contrast cu șobolanii slabi în care remodelarea a fost asociată cu o capacitate vasorelaxantă crescută a endoteliului. Dilatarea redusă dependentă de NO găsită la șobolanii obezi a fost cel mai probabil consecința unei producții excesive de ROS.

Disfuncția endoteliului găsită la șobolanii obezi a afectat selectiv endoteliul, deoarece am constatat că SNP, un donator direct de NO, a indus o relaxare similară la obezii și la șobolanii slabi (Figura S2), indicând faptul că reacția celulelor musculare netede la NO nu a fost afectată . Acest lucru este în acord cu un studiu anterior efectuat pe arterele mari. 26 În mod similar, contracția indusă de fenilefrină a fost similară la șobolanii obezi și slabi, sugerând că și contractilitatea celulelor musculare netede a fost păstrată.

Disfuncția endotelială observată la șobolanii obezi ne-a determinat să investigăm capacitatea arterelor de rezistență de a se adapta ca răspuns la o creștere cronică a fluxului sanguin. Această adaptare sau remodelare implică o creștere a diametrului asociată cu o dilatare crescută dependentă de endoteliu (NO). 9.16

Perspective

Studiul actual prezice afectarea reglării microvasculare și anomalii structurale în timpul sindromului metabolic. Deși s-a produs o remodelare „structurală” după creșterea cronică a fluxului sanguin, arterele au prezentat un diametru redus și o modificare exagerată a dilatației dependente de endoteliu. Acest lucru ar putea susține rezistența vasculară crescută, hipertensiunea arterială moderată sau oxigenarea limitată a organelor gazdă. În plus, modificarea endotelială după creșterea cronică a fluxului sanguin ar putea avea consecințe negative pe termen lung, atunci când pacienților care suferă de sindrom metabolic li se recomandă să practice exerciții fizice sau li se administrează tratamente vasodilatatoare pentru a îmbunătăți fluxul sanguin. 10.11

În concluzie, am identificat o disfuncție endotelială care apare după remodelarea indusă de fluxul sanguin ridicat, pe lângă disfuncția endotelială preexistentă care caracterizează obezii. Această constatare ar putea fi importantă de luat în considerare în tratamentul pacienților obezi care suferă de tulburări vasculare. Tratamentele care îmbunătățesc dilatarea dependentă de endoteliu, cum ar fi angiotensina I - inhibitori ai enzimei de conversie, 30 ar putea fi preferate pentru tratamentul bolilor cardiovasculare, cum ar fi hipertensiunea arterială, la subiecții obezi.

C.B. și E.B.d.C. a contribuit în mod egal la acest articol.

Mulțumim unității locale de îngrijire a animalelor de la Universitatea din Angers și Jérôme Roux, Pierre Legras și Dominique Gilbert pentru ajutorul amabil în tratarea șobolanilor.