Sumoilarea reglează funcția lamin A și se pierde în mutanții lamin A asociați cu cardiomiopatii familiale

Yu-Qian Zhang, Kevin D. Sarge; Sumoilarea reglează funcția lamin A și se pierde în mutanții lamin A asociați cu cardiomiopatii familiale. J Cell Biol 14 iulie 2008; 182 (1): 35-39. doi: https://doi.org/10.1083/jcb.200712124

Descărcați fișierul de citare:

Mutațiile Lamin A cauzează multe boli, inclusiv cardiomiopatii și sindromul Progeria. Atașarea covalentă a polipeptidelor mici modificatoare asemănătoare ubiquitinei (SUMO) reglează funcția multor proteine. Până în prezent, nu au fost cunoscute exemple de mutații cauzatoare de boli umane care apar în cadrul unei secvențe de consens de sumoilare și să altereze sumoarea. Arătăm că laminul A este sumoilat la lizina 201 și că doi mutanți ai laminului A asociați cu cardiomiopatia dilatată familială, E203G și E203K, prezintă sumoilare scăzută. E203 ocupă poziția conservată +2 în consensul de somoilare ΨKXE. Mutanții de Lamin A E203G, E203K și K201R prezintă cu toții o localizare subcelulară aberantă similară și sunt asociați cu moartea celulară crescută. Fibroblastele de la un individ cu mutația E203K lamin A au prezentat, de asemenea, o sumoilare scăzută a lamin A și o creștere a morții celulare. Aceste rezultate sugerează că modificarea SUMO este importantă pentru funcția normală de lamin A și implică o implicare pentru modificarea sumoilării în cardiomiopatiile E203G/E203K lamin A.

Introducere

Proteina lamin A joacă un rol important în structura și funcția nucleului, iar mutațiile genei lamin A provoacă un număr mare de boli umane diferite, inclusiv cardiomiopatii, distrofii musculare și sindromul Hutchinson-Gilford Progeria (Broers și colab., 2006; Capell și Collins, 2006; Mattout și colab., 2006; Parnaik și Manju, 2006). Atașarea covalentă a proteinelor mici modificatoare de tip ubiquitin (SUMO) la reziduurile de lizină din proteinele țintă sau sumoilarea este un regulator important al proprietăților funcționale ale proteinelor (Hay, 2005; Bossis și Melchior, 2006; Kerscher și colab., 2006). Proteinele SUMO sunt atașate covalent la resturile de lizină țintă de către enzima SUMO E2 ubc9, iar aceste lizine substrat se găsesc în mod obișnuit în secvența consens ΨKXE (Ψ reprezintă aminoacizii hidrofobi; Desterro și colab., 1997; Johnson și Blobel, 1997; Rodriguez și colab. al., 2001; Sampson și colab., 2001). Celulele exprimă trei paraloguri majore SUMO, SUMO-1, SUMO-2 și SUMO-3, SUMO-2 și -3 fiind mult mai asemănătoare între ele decât cu SUMO-1 (Hay, 2005; Kerscher și colab., 2006 Bossis și Melchior, 2006).

Folosind un ecran cu două hibrizi de drojdie, un studiu anterior a identificat o interacțiune între laminul A și ubc9, proteina SUMO E2 (Zhong și colab., 2005). Pe baza acestei interacțiuni, am emis ipoteza că proteina lamin A ar putea fi o țintă a somoilării. Scopul experimentelor din acest studiu a fost de a determina dacă laminul A este într-adevăr sumoilat în celule și, dacă da, ce rol joacă această modificare în reglarea funcției acestui lamin.

Rezultate si discutii

În primul rând, am căutat să testăm pentru somoiilarea laminului endogen A prin efectuarea imunoprecipitării extractelor de celule HeLa folosind anticorpi lamin A, urmată de Western folosind anticorpi împotriva SUMO-1 sau SUMO-2/SUMO-3 (din cauza similarității SUMO-2 și -3, este probabil ca ambele proteine ​​SUMO să fie recunoscute de acest anticorp). Rezultatele sugerează că laminul A este modificat SUMO și că este modificat preferențial de SUMO-2 în comparație cu SUMO-1 (Fig. 1 A). Rezultatele din Fig. 1 C indică faptul că proteina lamin A din extractele de inimă de șoarece este, de asemenea, sumoilată și că, la fel ca laminul A care este prezent în extractele de celule HeLa, SUMO-2 pare a fi proteina SUMO predominantă atașată la această proteină.

Analiza secvenței de aminoacizi a laminului A a dezvăluit o potrivire cu secvența consensului de sumoilare ΨKXE (MKEE) care înconjoară lizina 201 în domeniul care conține tija laminului A (Fig. 2 A, sus). Pentru a testa dacă sumoarea laminului A are loc la lizina 201, celulele HeLa au fost transfectate cu plasmide de expresie de mamifere care codifică constructele de fuziune GFP din laminul de tip sălbatic A și laminul A în care această lizină a fost schimbată într-o arginină neumoilatabilă (K201R), de-a lungul cu construcții de expresie care codifică SUMO-1 sau -2 marcate cu HA. Extractele celulelor transfectate au fost supuse imunoprecipitării cu anticorpi anti-GFP urmată de Western blot anti-HA. Rezultatele acestui experiment, în concordanță cu rezultatele obținute pentru laminul endogen A, au indicat faptul că proteina lamin A de tip sălbatic este modificată covalent de SUMO-2, dar nu la fel de eficient sumoiolată de SUMO-1 (Fig. 2 A, jos) . Rezultatele arată, de asemenea, că modificarea prin SUMO-2 nu este observată pentru proteina mutantă K201R lamin A, sugerând că lizina 201 este locul atașamentului SUMO-2 în această proteină.

Pentru a confirma efectele localizării modificate ale mutanților E203G și E203K lamin A asociați cardiomiopatiei într-un tip celular mai relevant din punct de vedere fiziologic, am repetat experimentele prezentate în Fig. 3 A în cardiomiocitele embrionare de șoarece. Rezultatele prezentate în Fig. 3 B, indică faptul că mutanții K201R, E203G și E203K lamin A prezintă modele de localizare aberante în cardiomiocite (comparativ cu laminul A de tip sălbatic) care sunt similare cu cele observate în celulele HeLa. Procentele de celule care prezintă localizare anormală a GFP de tip sălbatic și mutant - lamin A sunt prezentate în Tabelul S1.

Având în vedere modelele defectuoase de sumoilare și localizare aberantă ale proteinelor mutante K201R, E203G și E203K lamin A, am emis ipoteza că expresia acestor proteine ​​mutante lamin A ar putea duce la scăderea viabilității celulare. Rezultatele prezentate în Fig. 3 C indică faptul că acest lucru pare a fi cazul, deoarece toate aceste trei proteine ​​mutante lamin A sunt asociate cu moartea celulară crescută.

În setul final de experimente, am examinat fibroblastele cutanate obținute de la un pacient heterozigot pentru mutația E203K lamin A, care, așa cum s-a descris deja, este asociat cu cardiomiopatia (Jakobs și colab., 2001). Imunoprecipitarea laminului A din aceste celule, urmată de Western blot SUMO-2, indică faptul că, așa cum era de așteptat, nivelurile de somoilare ale laminului A sunt reduse în celule de la acest individ în comparație cu celulele unui individ normal (Fig. 4 A). Această persoană este heterozigotă pentru mutația E203K lamin A, deci ne așteptăm ca sumoilarea lamin A să fie redusă, dar nu eliminată. Mai mult, analiza imunofluorescenței laminului A a indicat mai multe celule care prezintă localizare anormală a laminului A și morfologie nucleară pentru fibroblastele E203K în comparație cu fibroblastele normale (Fig. 4 B). Procentele de fibroblaste normale și E203K care prezintă localizare anormală a laminului A/morfologie nucleară sunt prezentate în Tabelul S1. Fibroblastele E203K prezintă, de asemenea, moarte celulară crescută în comparație cu fibroblastele martor (Fig. 4 C).

Rezultatele prezentate în această lucrare indică faptul că lizina 201 a laminului A este o țintă a modificării covalente de către proteina SUMO-2 și că această sumoilare este importantă pentru modelul normal de localizare subcelulară a proteinei lamin A. Rezultatele acestor experimente arată, de asemenea, că sumoiilarea laminului A este scăzută în proteinele E203G și E203K lamin A mutante transfectate care cauzează cardiomiopatii familiale dilatate și în laminul A al fibroblastelor indivizilor cu mutația E203K. Din câte știm, acestea sunt primele exemple de mutații cauzatoare de boli umane care apar într-un reziduu crucial al unei secvențe consens de sumoilare și care duc la scăderea sumoilării proteinei mutante.

Rezultatele indică, de asemenea, că proteinele mutante E203G și E203K lamin A prezintă modele de localizare subcelulară modificate, care sunt foarte similare cu cea a proteinei mutante K201R lamin A a situsului de atașament SUMO. Aceste rezultate sugerează un rol pentru sumoilare în localizarea corectă a laminului A în celulă. Mai mult, celulele transfectate cu proteinele E203G și E203K lamin A și fibroblastele cutanate ale indivizilor cu mutația E203K prezintă niveluri mai ridicate de moarte celulară comparativ cu celulele transfectate cu lamin A de tip sălbatic sau respectiv cu fibroblaste normale ale pielii. Împreună, aceste rezultate sugerează că sumoilarea este importantă pentru funcția normală a laminului A și susține un rol pentru sumoarea modificată în mecanismul molecular subiacent al cardiomiopatiilor familiale dilatate asociate cu mutațiile E203G/E203K lamin A.

Materiale și metode

Cultură celulară și plasmide

Analiza imunoprecipitării

Analiza Western blot și anticorpi

SDS-PAGE și Western blot au fost efectuate conform procedurilor standard. Anticorpii și diluțiile utilizate pentru sondarea Western blot au fost după cum urmează. Anticorpul anti-GFP de capră (Bethyl Laboratories, Inc.) a fost utilizat la 1: 2.000, anticorpul anti-HA de șoarece (cadou de la laboratorul D. Andres, Universitatea din Kentucky, Lexington, KY) a fost utilizat la 1: 2.000, anti-capră SUMO-1 anticorp (Bethyl Laboratories, Inc.) a fost utilizat la 1: 1.000, iepure anti-SUMO-2 anticorp (Abgent) a fost utilizat la 1: 500, și iepure anti-lamin A anticorp (Abcam) a fost utilizat la 1: 1.000. 500.

Microscopie cu fluorescență și imunofluorescență

Test de viabilitate a celulelor albastre Trypan

Celulele au fost colectate prin centrifugare la 1.000 rpm timp de 10 minute la 4 ° C și peleta a fost spălată de două ori cu PBS. Peleta de celule a fost apoi resuspendată în PBS la o concentrație de ~ 106 celule/ml. O diluție unu la unu a suspensiei a fost preparată utilizând o soluție conținând 0,4% colorant albastru de tripan (Invitrogen), iar suspensia a fost apoi încărcată în camera de numărare a unui hemacitometru. S-a numărat numărul de celule colorate, precum și numărul total de celule, iar procentul de celule colorate a fost luat pentru a reprezenta procentul de deces celular. Au fost analizate trei seturi de date pentru fiecare experiment.

analize statistice

Semnificația statistică a fost determinată folosind testul t Student. O valoare p a 2+ tampon de digestie fără conținut de 0,5 mg/ml colagenază (tip II; Worthington) și 1 mg/ml pancreatină pentru două cicluri de 15 minute. Țesutul digerat a produs o fracțiune mare de celule care bat spontan în mediul de cultură constând din DME conținând 10% FBS.

Material suplimentar online

Tabelul S1 conține analize cantitative pentru experimentele din Fig. 3 (A și B) și Fig. 4 B. Acest tabel prezintă procentele de celule HeLa sau cardiomiocite transfectate cu GFP lamin A de tip sălbatic, K201R, E203G sau E203K mutanți care prezintă localizare anormală a laminului A și procentele fibroblastelor normale față de E203K lamin A care prezintă localizare anormală a laminului A/morfologie nucleară.

Abrevierea utilizată în această lucrare: SUMO, mic modificator asemănător ubiquitinei.

Mulțumiri

Suntem foarte recunoscători Dr. Ray Hershberger pentru furnizarea de fibroblaste cutanate de la persoanele normale și E203K lamin A, Dr. Nanbert Zhong și Dr. W. Ted Brown pentru plasmida pcDNA3.1-LMNA, Dr. Kim Orth pentru plasmidele de expresie HA - SUMO-1 și HA - SUMO-2, Dr. Doug Andres pentru anticorpi anti-HA, iar William Lester și Dr. Jon Satin pentru darul amabil al cardiomiocitelor embrionare. De asemenea, mulțumim membrilor laboratorului nostru pentru discuții înțelepte.

Această cercetare a fost susținută de grantul Institutului Național de Sănătate GM64606 către K.D Sarge.

• Ridgana a pierdut 57 de lire sterline de pierdere în greutate
• Sierras a pierdut greutatea apei, a crescut în timpul secetei - Schimbările climatice Semnele vitale ale planetei
• Pierderea în greutate Rita Simons EastEnders și eu; m O vedetă a celebrității a slăbit făcând asta
• Dieta cu orez De ce sunt asiatici subțiri Cum am pierdut 2 kg pe săptămână în medie, urmând această dietă leneșă de către Ema
• Mama care stă acasă a pierdut 16 kg cu un singur venit! Iată cum