Roluri Metodologie, Scriere - schiță originală

produce

Departamentul de afiliere pentru științe agricole și alimentare, Alma Mater Studiorum - Universitatea din Bologna, Cesena, Italia

Departamentul de afiliere pentru științe agricole și alimentare, Alma Mater Studiorum - Universitatea din Bologna, Cesena, Italia

Departamentul de afiliere pentru farmacie și biotehnologie, Alma Mater Studiorum - Universitatea din Bologna, Bologna, Italia

Roluri Analiza formală

Departamentul de afiliere pentru științe agricole și alimentare, Alma Mater Studiorum - Universitatea din Bologna, Cesena, Italia

Scrierea rolurilor - recenzie și editare

Departamentul de afiliere pentru farmacie și biotehnologie, Alma Mater Studiorum - Universitatea din Bologna, Bologna, Italia

Roluri Metodologie, Scriere - schiță originală

Departamentul de afiliere pentru științe agricole și alimentare, Alma Mater Studiorum - Universitatea din Bologna, Cesena, Italia

  • Francesca Patrignani,
  • Lorenzo Siroli,
  • Carola Parolin,
  • Diana I. Serrazanetti,
  • Beatrice Vitali,
  • Rosalba Lanciotti

Cifre

Abstract

Citare: Patrignani F, Siroli L, Parolin C, Serrazanetti DI, Vitali B, Lanciotti R (2019) Utilizarea Lactobacillus crispatus pentru a produce o brânză probiotică ca aliment potențial de gen pentru prevenirea infecțiilor ginecologice. PLoS ONE 14 (1): e0208906. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0208906

Editor: Pratyoosh Shukla, Universitatea Maharshi Dayanand, INDIA

Primit: 5 mai 2018; Admis: 17 noiembrie 2018; Publicat: 9 ianuarie 2019

Disponibilitatea datelor: Toate datele care stau la baza studiului se află în lucrare.

Finanțarea: Această lucrare a fost finanțată de GRANT ALMAIDEA 2017 acordat de Universitatea din Bologna. Beneficiar: Francesca Patrignani.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Într-adevăr, datorită numeroaselor diferențe fiziologice de gen (inclusiv răspunsurile fiziologice la multe patologii), se așteaptă ca alimentele dietetice și probiotice să influențeze în mod diferit sănătatea bărbaților și femeilor, deși modularea microbilor lor simbiotici [18]. Până în ultimul deceniu, cercetările asupra femeilor au fost ignorate, iar rezultatele obținute de la bărbați au fost direcționate direct către femei din mai multe domenii medicale [21]. Cu toate acestea, unele studii și studii controlate randomizate dedicate sexului feminin, au demonstrat capacitatea probioticelor, utilizate ca suplimente orale sau vaginale, de a se recupera de la tulburarea glicemică la femeile gravide sănătoase, mastita infecțioasă, infecțiile bacteriene și Candida genito-urinare [7, 22-24 ]. Mai mult, unele date din literatura de specialitate au arătat adecvarea alimentelor funcționale pentru a preveni bolile de inimă în vârstele post-menopauză, pentru a îmbunătăți sănătatea pielii femeii și pentru a afecta pozitiv microbiota intestinală și vaginală a femeilor HIV pozitive [25-28].

Femeile de vârstă reproductivă sunt adesea supuse unor anomalii ale microbiotei vaginale, ducând la infecții ginecologice, cum ar fi candidoză vulvovaginală, vaginoză bacteriană, vaginită aerobă și boli cu transmitere sexuală [29]. Aceste tulburări interferează cu sănătatea reproducerii feminine, favorizând avortul, nașterea prematură, ruperea prematură a membranelor și corioamnionita. Datele din literatură au arătat că tratamentele bazate pe abordări convenționale nu au avut succes în tratarea acestor tulburări și că utilizarea probioticelor poate fi eficientă în restabilirea microbiotei vaginale normale dominate de lactobacili [30].

Materiale și metode

Condiții de cultură pentru L. crispatus și brânză

L. crispatus BC4, un izolat vaginal capabil să contrasteze Candida spp. și alți agenți patogeni ai tractului urogenital [31,33,36], au fost folosiți în acest studiu pentru producerea unei brânze de testare. Culturile peste noapte (37 ° C timp de 16 ore) de L. crispatus au fost obținute în bulionul de Man-Rogosa-Sharpe (MRS) (Oxoid, Basingstoke, Marea Britanie) în stare anaerobă folosind kitul de generare a gazului Oxoid. Celulele au fost recoltate prin centrifugare la 8.000 × g timp de 20 minute la 4 ° C. Peleta rezultată a fost spălată de două ori cu soluție salină (0,9% NaCI în apă distilată) și resuspendată în lapte comercial pentru inoculuri în mediu industrial. O cultură liofilizată comercială de Streptococcus thermophilus St 0,20 (Sacco S.R.L., Como, Italia) a fost utilizată ca starter pentru producția de brânză Squacquerone. Cultura a fost inoculată în lapte în condiții optime și în proporțiile indicate de producător.

Brânzeturi Squacquerone

Producția de brânzeturi Squacquerone (brânză de test suplimentată cu L. crispatus BC4 și brânză de control) a fost realizată într-o fabrică pilot la o fermă de lactate locală (Mambelli, Bertinoro, Italia). încălzit și menținut la 42 ° C și inoculat cu cultura inițială comercială de S. thermophilus (concentrație finală: 6 log CFU/ml). Pentru a obține brânza Squacquerone testată, s-a adăugat L. crispatus BC4 (concentrație finală: 6,8 log CFU/ml). După 40 de minute, celor două loturi li s-au adăugat NaCI (0,7%) și 37 ml de cheag (12000 U, 80% chimozină și 20% pepsină, Bellucci Modena, Italia). La douăzeci de minute după coagulare, cașul a fost tăiat și transferat în matrițe tradiționale. Brânzeturile au fost lăsate să se odihnească până la atingerea pH-ului 5,15 și depozitate la 4 ° C. După o zi, brânzeturile au fost ambalate într-o atmosferă modificată și depozitate la 4 ° C timp de 18 zile.

Analize microbiologice, pH-ul și activitatea apei

pH-ul și activitatea apei au fost măsurate prin diluarea a 10 g de brânză cu 10 ml de apă distilată. pH-ul a fost înregistrat utilizând un pH-metru Hanna Instruments 8519 (Incofar, Modena, Italia). Activitatea apei (Aw) a fost măsurată utilizând un Aqualab Series 4TE (Decagon Device, Inc. Pullman, WA, SUA).

Proteoliză, lipoliză, profiluri volatile

Brânza testată suplimentată cu L. crispatus BC4 și brânza martor (fără L. crispatus BC4) au fost supuse proteolizei, lipolizei și profilului volatil. Proteoliza celor două tipuri de brânză a fost monitorizată prin SDS-PAGE. Proteinele solubile la pH 4,6 au fost extrase din supernatantele celor două tipuri de brânză urmând metoda propusă de Kuchroo și Fox [44] în timp ce condițiile de funcționare adoptate sunt în conformitate cu Tofalo și colab. [45]. Extracția lipidelor de brânză și determinarea concentrațiilor de acid gras liber (FFA) au fost efectuate așa cum a fost descris de Vannini și colab. [46]. Principalii compuși volatili au fost monitorizați utilizând o tehnică GC/MS/SPME conform metodei propuse de Burns și colab. [47]. Compușii au fost identificați prin utilizarea bazelor de date disponibile ale spectrelor de masă (versiunea NIST 2005).

Analize de profil textural

Brânza testată suplimentată cu L. crispatus BC4 și brânza martor (fără L. crispatus BC4) au fost supuse unei analize texturale peste depozitul frigorific. Analizele de textură au fost efectuate după 1, 4, 6, 8 și 13 zile de depozitare frigorifică utilizând un analizor de textură TA DHI (Stable MicroSystem, Godalming, Marea Britanie) și conform metodei propuse de Patrignani și colab. [2].

Evaluarea organoleptică

Brânza testată suplimentată cu L. crispatus BC4 și brânza martor (fără L. crispatus BC4) au fost supuse unei evaluări senzoriale peste depozitul frigorific. Evaluarea senzorială a fost efectuată pe parcursul unui test de panou după 4 și 13 zile de depozitare la 4 ° C. Douăzeci și cinci de comisari instruiți au fost înscriși în cadrul angajaților fermei lactate locale Mambelli (Bertinoro, Italia) (5 comisari) și al Departamentului de Științe Agricole și Alimentare, Universitatea din Bologna, Campus Food Science, Cesena, Italia (20 de comisari). Campusul de Științe Alimentare, unde a fost organizat testul, este furnizat de laboratoare senzoriale certificate în conformitate cu cerințele regionale. Comitetul care a organizat testul a fost informat verbal cu privire la fabricarea produselor din brânză și la tulpinile utilizate în cercetare. Comitetul a fost format de Dr. Patrignani, Dr. Siroli și prof. Lanciotti. Participanții, după consimțământul oral pentru efectuarea testului, au gustat 20 g din fiecare probă servită la 15 ° C în condiții controlate conform Standardului 8589 (ISO, 1988), așa cum sugerează Gallardo-Escamilla și colab. [48]. Evaluatorii au evaluat culoarea brânzei, aroma, cremositatea, aromele neplăcute, amara și acceptarea generală, atribuind un scor variind de la 0 (scăzut sau slab) la 5 (ridicat sau foarte excelent).

Evaluarea soartei populației de lactobacili (reprezentată în principal de L. crispatus BC4) prin trecerea simulată a duodenului stomacal și simulatorul ecosistemului microbian intestinal uman (SHIME)

Soarta L. crispatus BC4 a fost realizată prin simularea trecerii prin stomac și duoden, dezvoltată conform metodei propuse de Vinderola și colab. [49]. Pe scurt, 25 g de brânză testată au fost amestecate cu același volum al unei soluții „saliva-gastrice”. Soluția salivă-gastrică conținea CaCl2 (0,22 g⁄L), NaCI (16,2 g⁄L), KCl (2,2 g⁄L), NaHCO3 (1,2 g⁄L) și 0,3% (w⁄v) pepsină porcină. Pepsine porcine de la doi producători diferiți și nedezvăluite au fost utilizate pe bază de g⁄mL, deoarece pe eticheta produselor nu erau disponibile informații despre unitățile enzimatice. O probă de 1 ml a fost îndepărtată pentru numărarea celulelor imediat după amestec și pH-ul a fost rapid adus la 3,00, 2,70 sau 2,50, cu 5 M și 0,1 M HCI. Probele au fost aduse la 37 ° C într-o baie de apă. Alicote (1 ml) au fost luate la ora stabilită prin metodă și diluțiile seriale au fost placate pentru evaluarea viabilității celulei.

Destinul tulpinii vaginale L. crispatus BC4 în timpul trecerii în tractul gastrointestinal superior uman atunci când a fost livrat într-o matrice de brânză a fost evaluat și într-un sistem SHIME adaptat [50]. Acest sistem, compus dintr-un reactor utilizat într-o configurație secvențială pentru a simula în timp mai întâi stomacul și apoi mediul intestinal subțire, a fost folosit ca simulare precisă in vitro a capacității bacteriilor probiotice de a se uni în mediul intestinal [42]. ].

Timpul de retenție și pH-ul adecvat au fost alese pentru a semăna în condiții in vivo în diferite părți ale tractului gastro-intestinal în stare alimentată. Brânzeturile martor și test au fost incubate după cum sa raportat mai jos pentru a simula fazele gastrice și intestinale superioare, ambele lucrând în stare hrănită. La simulare s-au utilizat 2,5 g din fiecare brânză, toate experimentele au fost efectuate în triplicat pentru a explica variabilitatea biologică. De-a lungul simulării, au fost colectate următoarele probe: timpul 0, sfârșitul stomacului, intestinul subțire după 1, 2 și 3 ore. Viabilitatea tulpinii L. crispatus a fost evaluată prin intermediul tehnicilor convenționale de cultivare folosind mediu selectiv (MRS). Pentru confirmarea prezenței sale, a fost utilizată procedura descrisă anterior [43]. SHIME constă dintr-o succesiune de reactoare care simulează diferitele părți ale tractului gastro-intestinal uman. În această cercetare, reactorul SHIME simulează în timp, mai întâi stomacul și apoi intestinul subțire. Condițiile aplicate utilizate în simulator sunt rezumate mai jos:

Faza gastrică (stare alimentată): matricea de brânză a fost incubată la 37 ° C timp de 2 ore în condițiile brevetului SHIME [50], în timp ce se amesteca prin agitare, cu scăderea sigmoidală a profilului pH-ului. Pepsina a fost alimentată cu activitatea standardizată prin măsurarea creșterii absorbanței la 280 nm de produse solubile în TCA la digestia hemoglobinei (proteină de referință). S-a adăugat fosfatidilcolină și a urmat adăugarea de mediu nutrițional complex SHIME. Nivelurile de sare (NaCI și KCl) au fost implementate în conformitate cu Mackie și colab. [51].

Faza intestinului subțire (stare alimentată): Faza intestinului subțire a fost caracterizată printr-o incubație a matricei de brânză, după faza gastrică, la 37 ° C timp de 3 ore, în timp ce se amesteca prin agitare. În această etapă, pH-ul a crescut la 7,4. Enzimele pancreatice, într-un raport specific și definit, au fost utilizate în conformitate cu brevetul. A fost suplimentat 10 mM extract de bilă bovină.

analize statistice

Datele sunt exprimate ca media a trei repetări și două experimente independente. Datele microbiologice, chimico-fizice și de textură au fost analizate utilizând software-ul Statistica (versiunea 8.0; StatSoft, Tulsa, Oklahoma, SUA). Mijloacele au fost comparate folosind ANOVA urmat de testul LSD la p Fig 1.

Evoluția concentrațiilor Streptococcus thermophilus (a) și a populației Lactobacillus (b) în testarea și controlul brânzei Squacquerone în timpul depozitării refrigerate (1, 4, 6, 8, 11, 13 zile). Sarcinile celulare sunt exprimate ca Log CFU mediu/g brânză ± deviație standard. Controlul și testarea încărcăturilor de celule de brânză au fost comparate statistic la fiecare moment de prelevare. Comparând aceeași zi de prelevare, valorile încărcăturilor celulare ale brânzeturilor de testare și de control cu ​​simboluri diferite sunt semnificativ diferite (p. Tabelul 1. Evoluția pH-ului și a activității apei în testarea și controlul brânzeturilor prin depozitare refrigerată.

Profiluri de maturare a brânzeturilor

Proteină cu greutate moleculară: A1: 78,39 KDa; A2: 66,00 KDa; A3: 51,56 KDa; A4: 25,22 KDa; A5: 23,92 KDa; A6: 21,07 KDa; A7: 19,57 KDa; A8: 17,81 KDa; A9: 15,14 KDa; A10: 14,18 KDa.

Conținutul FFA de brânză înregistrat între 4 și 13 zile de depozitare la 4 ° C este prezentat în tabelul 2. După 4 zile de depozitare, brânza de control a prezentat profiluri FFA caracterizate prin C12: 0, C14: 0, C16: 0 și C18: 1, în timp ce brânza testată a fost caracterizată de C10: 0, C14: 0, C16: 0, C18: 0 și C18: 1. Pe parcursul stocării, în ambele tipologii de brânză eliberarea de FFA a crescut, chiar dacă cu tendințe diferite în raport cu prezența L. crispatus. C18: 0 a fost detectat în brânza de control după 6 zile de depozitare. 17 atomi de carbon ramificați anteiso, precum și acizi grași cu lanț lung, cum ar fi C18: 2 și C20: 0, au apărut în tipul de brânză testată între 6 și 13 zile de depozitare. Atât în ​​martor, cât și în brânză test, au apărut și 15 FFA-uri cu atom de carbon și C18: 2 după 6 zile de depozitare. Cu toate acestea, prezența L. crispatus BC4 a fixat eliberarea FFA-urilor, ale căror concentrații au atins un maxim la 8 zile de depozitare și apoi au scăzut probabil datorită transformării lor ulterioare în compuși aromatici. În schimb, în ​​brânza de control, acumularea de FFA raportate a continuat în timp și a atins punctul culminant la sfârșitul depozitării.

Profilele moleculare volatile ale celor două tipuri de brânză Squacquerone au fost monitorizate prin depozitarea refrigerată utilizând tehnica GC/MS/SPME. Moleculele detectate au aparținut diferitelor clase de compuși, cum ar fi alcooli, esteri, acizi și cetone. Pentru a evalua consecințele incluziunii L. crispatus BC4 în timp, compușii volatili detectați au fost analizați utilizând o analiză componentă principală (PCA). În Fig. 3, este raportată proiecția probelor și a moleculelor detectate. APC a reușit să explice peste 60% din varianța totală a eșantioanelor în timp. Toate probele de brânză test, independent de momentul depozitării, s-au grupat împreună, cu excepția brânzei test după 13 zile de depozitare, care a fost foarte asemănătoare cu cea de control în același timp de depozitare. La 1, 4 și 6 zile de depozitare, brânza test a fost caracterizată în principal de cetone și alcooli, în timp ce brânza martor a fost caracterizată de cetone, acizi grași scurți și esteri. La sfârșitul termenului de valabilitate, în ambele tipuri de brânză s-au găsit 2-butanonă, propanonă și, într-o cantitate mică, etanol.

Graficul de cazuri (a) și variabile (b) obținute prin elaborarea PCA a moleculelor volatile totale care caracterizează controlul și testarea brânzeturilor Squacquerone în raport cu timpul de depozitare refrigerat (1, 4, 6, 13 zile). CC1: controlați brânza după 1 zi de depozitare; CC4: controlați brânza după 4 zile de depozitare; CC6: controlați brânza după 6 zile de depozitare; CC13: controlați brânza după 13 zile de depozitare; PC1: Test brânza după 1 zi de depozitare; PC4: Testează brânza după 4 zile de depozitare; PC6: Testează brânza după 6 zile de depozitare; PC13: Test brânza după 13 zile de depozitare.

Test panou

Analiza senzorială a fost efectuată pe cele două tipuri de brânză după 4 și 13 zile de depozitare și a arătat că brânza testată a fost preferată în comparație cu martorul (Fig 4). De fapt, după 4 zile, brânza de testat a primit un scor semnificativ mai mare comparativ cu brânza de control pentru acceptarea generală. Această evaluare pozitivă a fost afectată în principal de caracteristicile senzoriale, cum ar fi cremozitatea, aroma și lipsa de arome, echilibrând scorurile scăzute primite pentru atributul de culoare. După 13 zile de depozitare, diferențele senzoriale percepute de membrii comisiei au fost reduse semnificativ, deși brânza test a rămas mai apreciată decât controlul pentru toți parametrii luați în considerare.

Diagrama cu pânză de păianjen a datelor senzoriale de control și testare a brânzeturilor Squacquerone după 4 (a) și 13 (b) zile de depozitare frigorifică. Evaluarea senzorială a probelor, evaluată de un panou de evaluare instruit, a luat în considerare culoarea brânzei, aroma, cremositatea, aromele neplăcute, amara și acceptarea generală atribuind un scor variind de la 0 (slab) la 5 (foarte excelent).

Profil textural

Analizele texturale ale durității și consistenței la depozitarea frigorifică sunt raportate în Fig 5, respectiv. În ceea ce privește duritatea, au fost evaluate diferențe semnificative între cele două tipuri de brânză Squacquerone pentru orice timp de depozitare considerat (1-13 zile). S-a constatat o consistență semnificativ diferită între cele două produse din brânză până la 8 zile de depozitare frigorifică.

Analize texturale ale durității (a) și consistenței (b) evaluate în controlul și testarea brânzeturilor Squacquerone în timpul depozitării refrigerate (1, 4, 6, 8, 13 zile). Rezultatele sunt exprimate ca medie ± deviație standard. Pentru analiza statistică, brânzeturile de control și test au fost comparate la fiecare moment de prelevare. Comparând aceeași zi de prelevare a probelor, valorile texturale ale brânzeturilor de control și ale brânzeturilor de testare cu majuscule diferite au fost semnificativ diferite (p Fig 6. Evoluția încărcăturilor de celule ale populației Lactobacillus în brânza de test Squacquerone la 4 și 13 zile de depozitare frigorifică, supuse simulării stomac- pasaj duoden.

Sarcinile celulare sunt exprimate ca Log CFU mediu/g brânză ± deviație standard. Valorile încărcăturii celulare înregistrate după 4 zile de refrigerare a brânzei au fost comparate statistic în raport cu stresul aplicat. Valori semnificative diferite sunt evidențiate cu o literă supercript diferită (p Fig. 7. Evoluția încărcăturilor de celule ale populației Lactobacillus în brânza Squacquerone testată la simulatorul ecosistemului microbian intestinal uman (SHIME).