Yabin Duan

1 Departamentul de Farmacie Clinică, Spitalul Afiliat al Universității Qinghai, Xining, Qinghai 810001, P.R. China

citokinelor

Xingchen Yao

2 Departamentul de Oncologie Radioterapică, Spitalul Popular Qinghai, Xining, Qinghai 810007, P.R. China

Junbo Zhu

3 Departamentul de Farmacie, Colegiul Medical, Universitatea Quinghai, Xining, Qinghai 810001, P.R. China

Yongping Li

4 Departamentul de Medicină Tradițională Chineză, Colegiul Medical, Universitatea Quinghai, Xining, Qinghai 810001, P.R. China

Juanling Zhang

5 Departamentul de Resurse Biologice, Colegiul de Inginerie Eco-Mediu, Universitatea Qinghai, Xining, Qinghai 810016, P.R. China

Xuejiao Zhou

5 Departamentul de Resurse Biologice, Colegiul de Inginerie Eco-Mediu, Universitatea Qinghai, Xining, Qinghai 810016, P.R. China

Yijie Qiao

3 Departamentul de Farmacie, Colegiul Medical, Universitatea Quinghai, Xining, Qinghai 810001, P.R. China

Meng Yang

5 Departamentul de Resurse Biologice, Colegiul de Inginerie Eco-Mediu, Universitatea Qinghai, Xining, Qinghai 810016, P.R. China

Xiangyang Li

6 Medical College, Qinghai University, Xining, Qinghai 810016, P.R. China

7 Laboratorul cheie de stat al ecologiei și agriculturii platoului, Universitatea Qinghai, Xining, Qinghai 810016, P.R. China

Abstract

Introducere

Radiațiile ionizante au aplicații pozitive în producția agricolă, medicină și sănătate, cercetarea științifică și apărarea națională (1). Cu toate acestea, dăunează și multor aspecte ale fiziologiei umane, inclusiv celulelor sanguine periferice, ADN-ul măduvei osoase (2), organele imune (3) și enzimele antioxidante (4,5). Institutul de Cercetare al Armatei Statelor Unite a dezvoltat primul medicament anti-radiații, amifostina, care a fost aprobat de Administrația SUA pentru Alimente și Medicamente (6). Amifostina este capabilă să reducă semnificativ moartea celulelor normale după radioterapie; cu toate acestea, efectele secundare, inclusiv hipotensiunea, greața, vărsăturile și alte reacții adverse, au restricționat utilizarea acestuia (7). Prin urmare, studiile sunt justificate pentru a identifica un medicament natural non-toxic eficient, care protejează împotriva radiațiilor și reduce daunele cauzate de radiații. Studiile anterioare au documentat că proteinele vegetale (8,9) și proteinele care nu leagă fierul (10-12) exercită efecte protectoare împotriva radiațiilor. În plus, arginina, glutamina, glicina, aminoacizii asemănători micosporinei și aminoacizii esențiali pot favoriza recuperarea în greutate, îmbunătăți condițiile nutriționale ale proteinelor și exercita efecte anti-oxidante la șobolanii expuși la iradiere cu raze X (13-15).

Un studiu anterior al autorilor a arătat că proteinele activate de Yak sunt extrase din țesutul sănătos al iacilor din Platoul Qinghai-Tibetan și s-a constatat că conțin un număr mare de peptide mici (nepublicate). Proteina activată prin yak a fost identificată inițial în urma tratamentului țesuturilor izolate din iac cu o combinație de radioterapie și chimioterapie, prin care numărul de celule albe din sânge matur s-a dovedit a fi normal, în timp ce activitatea celulelor T, a celulelor ucigătoare naturale, a monocitelor și a neutrofilelor a fost neobișnuit înalt. Țesutul izolat de iac este de obicei preparat folosind metode de extracție, separare și purificare cu tehnologii moderne aplicate de biotehnologie și inginerie biologică, permițându-i să fie absorbit direct fără digestie în tractul intestinal. Există multe surse de proteine ​​activate de iacuri în Platoul Qinghai-Tibetan. Proteina activată cu yak oferă o nutriție bogată fără toxicitate, nu se acumulează în organism și acționează ca un factor multifuncțional (16). Mai mult, este capabil să inhibe creșterea tumorii, să mărească numărul de celule albe din sânge și să regleze sistemul imunitar (17).

Scopul prezentului studiu a fost de a evalua efectul proteinei activate de iac asupra celulelor sanguine periferice, funcția imunitară, conținutul de ADN al măduvei osoase, activitatea enzimatică antioxidantă și expresia proteinelor asociate apoptozei în leziunile provocate de radiații la șoareci. Au fost, de asemenea, investigate mecanismele care stau la baza cu privire la efectele protectoare potențiale ale proteinelor activate de iac. Rezultatele studiului actual pot indica metode noi de studiere a agenților de protecție împotriva radiațiilor și aplicațiile clinice ale proteinei activate de iac.

Materiale și metode

Materiale și reactivi

Hidroliza probei

Proteina activată cu iac (33,5 mg) a fost plasată într-o sticlă de amper de 10 ml și s-au adăugat 6 ml de HCI (6 mol/l). Flaconul a fost sigilat și incubat timp de 24 de ore la 110 ° C pentru hidroliza probei. Proba a fost apoi răcită la temperatura camerei timp de 40 min, filtrată (dimensiunea porilor, 0,5 um) și lichidul de filtrare a fost adăugat într-un tub de 15 ml. Tubul a fost uscat sub vid la 90 ° C într-un evaporator Multivapor. După uscare, reziduul a fost dizolvat în apă și etapa menționată mai sus a fost repetată. În cele din urmă, reziduul evaporat a fost dizolvat în 5 ml HCI (20 mmol). Proba a avut o hidroliză nedeterminată atunci când flaconul a fost sigilat și incubat timp de 24 de ore la 110 ° C. După filtrare pentru îndepărtarea impurităților, proba a fost conținută în lichidul de filtrare și apoi s-a adăugat HCI (20 mmol) pentru a dizolva proba.

Derivatizarea probei

Probele (0,4 ml) au fost adăugate la 1 ml de bicarbonat de sodiu (0,5 mol/l) și 0,4 ml de soluție de fluorobenzen acetonitril (1%) într-un balon volumetric (10 ml). Balonul a fost incubat la 60 ° C timp de 1 oră și s-a adăugat o soluție tampon de dihidrogen fosfat de potasiu (0,1 mol/l, pH 7). Amestecul a fost filtrat printr-o membrană microporoasă (pori 0,22 µm), apoi imediat supus cromatografiei lichide de înaltă performanță, după cum urmează.

Condiții de detectare cromatografică

Au fost utilizate următoarele condiții cromatografice: Coloană, Phenomenex Gemini 5 µ C18 (250 × 4,6 mm; Phenomenex, Inc., Torrance, CA, SUA); detectarea lungimii de undă, 360 nm; temperatura coloanei, 37 ° C; debit, 1 ml/min, sarcină probă, 8; l; și o eluție în gradient a fazei mobile A (0,05 mol/l acetat de sodiu; pH 6,4) și a fazei mobile B (acetonitril: apă = 1: 1; Tabelul I).

Tabelul I.

Probele de aminoacizi separate prin cromatografie cu eluție în gradient.

Timp, min Solvent A (0,05 mol/l acetat de sodiu; pH 6,4),%
0-574-65
5-1565-60
15–2060-45
20-2545–30
25-3030–20
30–3520-2
35-402–2
40-422-74

Grupe de animale și regimuri de dozare

Un total de 180 de șoareci masculi Kunming (6-8 săptămâni, 22-25 g) au fost achiziționați de la Centrul Experimental pentru Animale al Universității de Medicină Tradițională Chineză Gansu (Lanzhou, China). Animalele au fost adaptate timp de o săptămână la 23 ± 2 ° C, cu o umiditate constantă de 55 ± 5% sub un ciclu de lumină-întuneric de 12 ore și cu acces ad libitum la apă și pelete alimentare. În fiecare cușcă erau adăpostite 10 animale. Un total de 60 de șoareci au fost împărțiți în mod aleatoriu în control normal, control iradiat, control pozitiv (amifostină, 150 mg/kg) și grupuri proteice cu doze mari, medii și mici, activate de iac (10, 5 și respectiv 2,5 mg/kg; n = 10). Ceilalți 120 de șoareci au fost folosiți pentru experimentele ulterioare în zilele 7 și 14 după radiație, respectiv, pentru a evalua modificările diferiților indicatori la diferite momente de timp. Grupurile de control normale și de control iradiate au primit soluție salină normală pe cale orală și tuturor celorlalte grupuri de tratament li s-a administrat proteină activată cu iac (10, 5 sau 2,5 mg/kg) pe cale orală timp de 14 zile. Șoarecii din lotul martor pozitiv au fost tratați cu o injecție intraperitoneală de amifostină (150 mg/kg) cu 30 de minute înainte de iradiere. Șoarecii au fost anesteziați cu injecție enterocoelică de 50 mg/kg de pentobarbital de sodiu 1% (Propbs Bio-tech Co. Ltd, Beijing, China) înainte de experimente.

Model de deteriorare prin radiații

Spitalul afiliat al Universității QingHai a fost utilizat pentru experimentul de iradiere. Toți șoarecii, cu excepția grupului de control, au fost reținuți în cutii speciale și expuși la radiația X a corpului total de 5,0 Gy la o rată de 300 cGy/min o dată. Distanța sursă-animal a fost de 100 cm. Timp de radiație: 100 sec (18.19). După expunerea la radiații, 180 de șoareci au fost folosiți în zilele 3, 7 și 14.

Colectie de mostre

Șoarecii au fost anesteziați cu injecție enterocoelie de 50 mg/kg pentobarbital de sodiu 1% înainte de experimente. Sângele ocular a fost recoltat de la șoareci în toate grupurile de tratament la 7 zile după iradiere. Fiecare probă a fost amestecată cu EDTA-2Na (Mingyuan Industry Co., Ltd, Zhengzhou, China) pentru a preveni coagularea, iar restul a fost coagulat pentru a separa serul prin centrifugare la 1.000 × g timp de 10 minute la 4 ° C. Toți șoarecii au fost sacrificați cu injecție enterocoelia de 50 mg/kg pentobarbital de sodiu 5% la 3, 7 și 14 zile după iradiere (n = 60 pentru toate grupurile). După sacrificiu, timusul și splina (fără grăsime) au fost recoltate, clătite cu soluție salină pentru îndepărtarea sângelui, uscate cu hârtie de filtru și cântărite.

Numărul de celule și indicii organelor

Diluanții de celule sanguine (catalog nr. M-23D, lot 2013110701; Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd, Shenzhen, China) au fost adăugați în 20 ocl sânge ocular conform protocolului producătorului. Numărul de celule sanguine (leucocite-WBC, eritrocite-RBC, hemoglobină-HGB și trombocite-PLT) a fost determinat folosind un analizor de celule sanguine BC-2300 (Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.). Indicii organelor au fost calculați utilizând următoarea formulă: Indicele organelor (%) = Greutatea organelor (g)/greutatea animalelor (g) × 100 (20).

Conținutul de ADN al măduvei osoase

Șoarecii au fost sacrificați după recoltarea sângelui ocular. Femurul drept a fost izolat și țesutul muscular și sângele au fost îndepărtate. O parte a capului femural a fost tăiată și s-au folosit 10 ml de CaCl2 (0,005 mol/l) pentru a spăla măduva osoasă într-un tub de centrifugă. Măduva osoasă a fost plasată într-un frigider la 4 ° C timp de 30 de minute, apoi centrifugată la 693 × g timp de 15 minute la 4 ° C. Supernatantul a fost aruncat și s-au folosit 5 ml de 0,2 mol/l HCI04 pentru acidularea precipitatului. Precipitatul a fost apoi agitat, încălzit la 90 ° C timp de 15 min, răcit, centrifugat la 1.350 × g timp de 10 min la 4 ° C și filtrat (pori 50 um). Absorbanta (A) a supernatantului a fost determinata folosind un spectrofotometru UV la 268 nm. Conținutul de ADN a fost calculat conform următoarei formule: ADN (µg) = 40 × 50 × A (21).

Conținutul IL-2 și IL-6 și expresia Bcl-2 și Bax. Kituri ELISA (Bcl-2; Nr. Cat. 20141227.60284M; Bax; Nr. Cat. 20141227.60283M; IL-2; Nr. Cat. 20141227.60019M; IL-6; Nr. Cat. 20141227.60023M; Beijing RigorBio Science Development Co ., Ltd.) au fost utilizate pentru a măsura nivelurile de IL-2, IL-6, Bcl-2 și Bax în ser, conform protocolului producătorului.