Abstract

Metformina este unul dintre cele mai frecvent utilizate medicamente pentru tratamentul diabetului de tip 2. Este un medicament hipoglicemiant eficient care îmbunătățește, de asemenea, profilurile lipidice (1) și reduce riscul cardiovascular (2). Programul de prevenire a diabetului sa dovedit recent a fi similar cu dieta și exercițiile fizice, tratamentul cu metformină reduce riscul de a dezvolta diabet la persoanele cu intoleranță la glucoză (3). În timp ce majoritatea studiilor au arătat că efectele de scădere a glucozei ale metforminei sunt secundare unei scăderi a producției hepatice de glucoză (1,4-6), un corp semnificativ de date sugerează, de asemenea, că acest medicament crește eliminarea glucozei în mușchiul scheletic (1,7, 8); cu toate acestea, locul său molecular de acțiune rămâne neclar.

activitatea

Proteina kinază activată cu AMP (AMPK) este o enzimă heterotrimerică compusă dintr-o subunitate catalitică (α) și două subunități reglatoare (β și γ) (9,10). Există două izoforme ale subunității catalitice: AMPK α1, care este distribuită pe scară largă, și AMPK α2, care se exprimă în mușchiul scheletic, inima și ficatul (11). AMPK funcționează ca un indicator de combustibil intracelular care se activează prin scăderea raportului ATP/ADP și fosfocreatină (PCr)/creatină prin mecanisme care implică fosforilarea de către una sau mai multe kinaze AMPK din amonte, activarea alosterică și o scădere a acțiunii inhibitoare a fosfatazelor ( 9,12, 13). Creșterea activității AMPK are ca rezultat stimularea absorbției glucozei în mușchi, oxidarea acizilor grași în mușchi și ficat și inhibarea producției hepatice de glucoză, a sintezei colesterolului și a trigliceridelor și a lipogenezei (14).

Activarea chimică a AMPK cu compusul 5-aminoimidazol-4-carboxamidă ribonucleozidă (AICAR) duce la creșterea absorbției glucozei (15-19) și la sensibilitatea crescută la insulină în mușchi (20,21). AICAR nu poate stimula absorbția de glucoză musculară la șoarecii care poartă un mutant AMPK mort kinazic în mușchi (19). În celulele hepatice, activarea AMPK cu AICAR determină inhibarea producției de glucoză (22-24). Pe baza acestor asemănări între efectele metabolice ale AICAR și ale metforminei în ficat și mușchi, am testat anterior posibilitatea ca AMPK să poată fi implicat în medierea acțiunilor metabolice ale metforminei în țesutul animal (25). Metformina a crescut semnificativ activitatea AMPK în hepatocitele de șobolan cultivate și în mușchii izolați și, important, activarea enzimei a fost asociată cu producția diminuată de glucoză de către hepatocite și cu o absorbție mai mare de glucoză musculară (25). Pentru a investiga dacă activarea AMPK de către metformină este un mecanism probabil pentru efectele sale metabolice la subiecții cu diabet zaharat de tip 2, în studiul de față, am examinat dacă tratamentul cu acest medicament modifică activitatea isoformelor AMPK α1 și α2 în mușchiul scheletic.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Subiecte.

Opt subiecți cu diabet zaharat de tip 2 (șapte bărbați și o femeie) au fost studiați înainte, în timpul și după 10 săptămâni de tratament cu metformină. Studiul a fost aprobat de Comitetul Etic al Institutului Karolinska. Subiecții au fost informați cu privire la scopul studiului și la potențialele efecte secundare ale medicamentului. Consimțământul scris a fost obținut de la toți subiecții. Diagnosticul diabetului de tip 2 a fost pus de către medicii subiecților pe baza criteriilor publicate (26). Creatinina serică și amino transferazele au fost măsurate la momentul inițial pentru a exclude bolile renale sau hepatice în curs de desfășurare. Trei subiecți luau o sulfoniluree, doi metformină și trei o combinație a ambelor medicamente. Subiecții au fost excluși dacă au avut antecedente de boli sistemice (altele decât diabetul) sau au luat orice alt medicament despre care se știe că afectează metabolismul carbohidraților în mușchi.

Protocol de studiu.

Testul activității AMPK și imunoblotarea.

Probele de mușchi au fost omogenizate așa cum s-a descris anterior (29), iar lizatele au fost utilizate pentru determinarea activității AMPK și imunoblotarea. Activitatea AMPK a fost determinată după imunoprecipitarea a 200 μg de proteine ​​folosind anticorpi specifici produși împotriva secvențelor de aminoacizi 339-358 ale AMPK α1 și 352-366 din α2 așa cum s-a descris anterior (29). Reacția a fost făcută utilizând peptida sintetică HMRSAMSGLHLVKRR ca substrat (30). Activitatea AMPK este exprimată ca ATP încorporat (picomoli) pe miligram de proteină pe minut. Imunoblotarea s-a făcut așa cum s-a descris anterior (29). Pe scurt, proteinele (60 μg) din lizatele musculare au fost separate cu 8% SDS-PAGE și transferate în membranele nitrocelulozice. După blocare, membranele au fost incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorpul împotriva AMPK α2 descris mai sus (3 μg/ml) sau cu anti-fosfo-AMPK (Thr172) (3 μg/ml; Cell Signaling, Beverly, MA). Anticorpii legați au fost detectați cu anticorp întreg legat de peroxidază de imunoglobulină anti-iepure și prin utilizarea reactivilor chemiluminescenți îmbunătățiți (ECL) (NEN Life Science Products, Boston, MA). Membranele au fost expuse la film, iar benzile au fost cuantificate utilizând software-ul ImageQuant (Molecular Dynamics).

Activitate acetil-CoA carboxilază-2.

Proteinele (200 μg) din lizatele musculare au fost imunoprecipitate prin incubare peste noapte la 4 ° C folosind un anticorp policlonal anti-acetil-CoA carboxilază (ACC) -2 anticorp ridicat împotriva secvenței SRQKPPRNPLSSSD și proteine ​​A margele în tampon A (20 mmol/l Tris, pH 7,5, 1% Triton X-100, 50 mmol/l NaCl, 250 mmol/l zaharoză, 50 mmol/l NaF, 5 mmol/l NaPPi, 2 mmol/l ditiotreitol, 4 mg/l leupeptină, 50 inhibitor al tripsinei mg/l, 0,1 mmol/l benzamidină și 0,5 mmol/l fluorură de fenilmetilsulfonil). Margelele au fost apoi spălate de trei ori cu tampon A și o dată cu tampon de testare ACC (60 mmol/l Tris, pH 7,5, 5 mmol/l MgCl2, 1 mg/ml BSA și 1,2 mmol/l β-mercaptoetanol) urmate de determinare de activitate ACC utilizând metoda de fixare a 14 CO2 în prezența de 10 mmol/l citrat și 1 mmol/l ATP (31).

Concentrațiile de ATP, PCr și glicogen în mușchi.

Concentrațiile de ATP și PCr au fost determinate în extracte de acid percloric din mușchi înghețat conform metodei Lowry și Passonneau (32). Pentru măsurarea glicogenului, mușchii au fost hidrolizați în HCI 2 N la 100 ° C timp de 2,5 ore, urmat de neutralizare cu NaOH 2 N. Conținutul de glicogen a fost apoi măsurat prin metoda hexokinazei utilizând reactivul glucoză HK (Sigma, St. Louis, MO) și exprimat pe miligram de proteină.

Studii de clamp hiperinsulinemic-euglicemic, metodologie de trasare și calorimetrie indirectă.

Eșantionare și analiză chimică.

Concentrațiile de glucoză în circulație și 6,6-d 2-d-glucoză au fost determinate la fiecare 10 minute în perioadele de timp definite mai jos. Datele au fost colectate pentru perioadele de 30 de minute imediat înainte de începerea perfuziei de insulină (bazală) și ultimele 30 de minute ale clemei de 150 de minute. Concentrațiile de glucoză din sânge au fost determinate imediat după colectare (27). Plasma a fost prelevată la fiecare 10 minute în perioadele de 30 de minute în starea de echilibru pentru determinarea îmbogățirii cu 6,6-d 2-glucoză. Derivatul de trimetil-O-metiloximă al infuzatului de plasmă și glucoză a fost măsurat prin spectroscopie de masă prin cromatografie gazoasă (36). Mediile de 30 de minute au fost utilizate pentru a determina măsurătorile de rotire a glucozei.

analize statistice.

Datele sunt prezentate ca mijloace ± SE. Analiza datelor s-a făcut folosind un ANOVA unidirecțional cu măsuri repetate (diferențele dintre medii au fost determinate cu testul Student-Newman-Keuls) sau folosind un test t asociat. Corelația dintre activitatea AMPK α2 și eliminarea glucozei pe tot corpul s-a făcut folosind corelația Spearman de rang.

REZULTATE

Caracteristicile clinice și metabolice ale subiecților înainte și după tratament.

Durata medie a diabetului de tip 2 a fost de 3,9 ani, variind de la 1 la 8 ani (Tabelul 1). Subiecții au avut o scădere mică a greutății după 10 săptămâni de tratament (2,2%), în timp ce IMC și masa fără grăsimi nu s-au modificat semnificativ. După 10 săptămâni de tratament, concentrațiile glicemiei și insulinei serice au scăzut cu 14 și, respectiv, 28% (Tabelul 1). În ciuda îmbunătățirii glicemiei, valorile HbA1c nu au scăzut semnificativ (HbA1c normal, + în fracțiile citosolice și mitocondriale, dar metformina singură la concentrații mai mari a crescut NADH/NAD + (56). El Mir și colab. (38) au arătat că inhibarea complexului 1 al lanțului respirator în hepatocite este însoțită de creșteri ale raportului lactat/piruvat și 3-hidroxibutirat/acetoacetat, sugerând că, în anumite condiții, metformina poate modifica starea redox. starea energiei musculare și activitatea AMPK după cronic tratamentul cu metformină observat în acest studiu este asociat cu modificări ale respirației mitocondriale și stării redox.

Similar activării AMPK de metformină în celulele hepatice (25), inhibarea complexului 1 în mitocondriile izolate din hepatocitele tratate cu metformină crește cu timpul (39). Aceste constatări sunt, de asemenea, în concordanță cu o acumulare prelungită de metformină în diferite țesuturi în timpul administrării orale a medicamentului la șoareci (57) și ar putea explica de ce în prezentul studiu activarea AMPK α2 a fost susținută după retragerea metforminei. T1/2 al AMPK α2 în mușchiul scheletic nu este cunoscut, dar este puțin probabil ca activarea susținută a AMPK α2 observată în studiu să fie legată de t1/2 a proteinei sau de un timp prelungit pentru recuperarea activității enzimei, deoarece noi (43) și alții (58) am arătat că activitatea AMPK revine la valoarea inițială în decurs de 10 minute după un stimul acut, cum ar fi contracția musculară.

Efectul metforminei asupra activității AMPK este specifică izoformei, deoarece a fost activată doar subunitatea catalitică α2. În mușchii scheletici de la subiecții diabetici și nondiabetici, ARNp AMPK α2 constituie majoritatea (două treimi) a ARNm α în comparație cu α1 (29). Similar administrării metforminei la oameni, studiile de efort au arătat că AMPK α2 este izoforma activată în timpul rulării cu intensitate moderată care rulează atât la șobolani (43), cât și la oameni (29,59, 60), în timp ce AMPK α1 rămâne neschimbată. Acest rezultat sugerează că izoforma α2 și nu α1 este responsabilă în principal de reglarea efectelor metabolice in vivo mediate de AMPK atât ale metforminei, cât și ale exercițiilor fizice în mușchiul scheletic.

Nu este clar dacă stabilizarea sau reducerea greutății corporale produse de metformină se datorează efectelor centrale (suprimarea apetitului) sau periferice (1). Tratamentul cronic atât cu AICAR (61), cât și cu metformină (4) scade masa grasă. Mai mult, șoarecii knockout ACC mențin sau pierd greutate în ciuda aportului crescut de alimente (62). Aceste descoperiri ridică posibilitatea ca AMPK să medieze, cel puțin parțial, efectele metforminei asupra greutății corporale.

Specificitatea AMPK ca țintă moleculară a metforminei este încă de determinat și va fi interesant să se examineze dacă alți agenți sensibilizatori la insulină modifică, de asemenea, activitatea AMPK în ficat și țesuturile periferice. Căutarea unor agenți selectivi și mai puternici care activează AMPK, proiectați pentru tratamentul diabetului de tip 2, vor fi, de asemenea, un domeniu important pentru investigații viitoare.