Abstract

O celulă dată face schimburi cu vecinii săi printr-o varietate de mijloace, de la factori difuzibili la vezicule. Celulele folosesc, de asemenea, nanotuburi tunelate (TNT), structuri membranice care conțin actină filamentoasă, care pun în legătură și conectează celulele. Descrise mai întâi în celulele imune, TNT facilitează transferul HIV-1 și se găsesc în diferite tipuri de celule, inclusiv neuroni. Arătăm că proteina Tau, asociată microtubulilor, un jucător cheie în boala Alzheimer, este un component de bună-credință al TNT. Acest lucru este important deoarece Tau apare lângă actina filamentoasă și miozina 10 ca un marker specific al acestor proeminențe fine ale membranelor și citosolului care sunt dificil de vizualizat. Mai mult, am observat că speciile de Tau exogene cresc numărul de TNT stabilite între neuronii primari, facilitând astfel transferul intercelular al fibrilelor de Tau. În concluzie, Tau poate contribui la formarea și funcționarea TNT-urilor extrem de dinamice care pot fi implicate în propagarea asemănătoare prionică a ansamblurilor Tau.

mediat

Introducere

Înțelegerea transmiterii unui agent infecțios de la o celulă la alta a fost o provocare a secolului trecut. A fost demonstrată implicarea receptorilor de la suprafața celulei, dar au fost descrise și alte căi. Nanotuburile de tunelare (TNT) formează o astfel de cale. TNT-urile au fost descrise în diferite tipuri de celule, inclusiv celule neuronale și imune. Sunt structuri membranare care conțin actină filamentoasă, cu un diametru de la 50 la 800 nm, nu întotdeauna legate de substrat și formând punți care leagă celulele îndepărtate [1-6]. De exemplu, TNT-urile conectează fizic celulele T, prezentând o nouă cale pentru transmiterea HIV-1 [7]. În astfel de celule, tipul de TNT este o zonă activă de reorganizare a citoscheletului actinic și conține ezrin, Exo70, miozină 10 și N-WASP, sugerând o reglare la nivel celular [8, 9]. Factori extrinseci, cum ar fi acidul arahidonic în celulele endoteliale [10], infecția cu HIV-1 în macrofage [11], stresul oxidativ [12] și proteinele asemănătoare prionilor (de exemplu, fibrilele Huntingtin, TDP-43) în celulele neuronale [6, 13, 14] s-a demonstrat că declanșează formarea TNT.

Multe agregate de proteine ​​au proprietăți asemănătoare prionilor: pot acționa ca șabloane de auto-propagare. Acestea perturbă proteostazia celulară, ducând în cele din urmă la tulburări neurodegenerative precum boala Alzheimer (AD), boala Parkinson (PD), scleroza laterală amiotrofică (SLA) sau encefalopatiile spongiforme transmisibile (EST) [15-17]. Mecanismele exacte ale răspândirii celule-la-celule a speciilor patologice sunt încă supuse unei investigații intense. Printre altele, rolul TNT în această propagare a fost sugerat în boala Huntington, boala Parkinson și SLA/demență fronto-temporală [18]. În ceea ce privește boala Alzheimer, s-a demonstrat că peptida amiloidă Aβ circulă prin TNT și induce citotoxicitate [12]. Rolul TNT-urilor în răspândirea Tau agregată nu a fost încă documentat.

În lucrarea de față, folosind două modele celulare diferite (celule neuronale CAD și neuroni corticali embrionari primari de șobolan), am demonstrat că speciile de Tau extracelulare acționează ca un factor extrinsec ducând la formarea crescută a TNT, care la rândul său facilitează răspândirea intercelulară a Tauului patologic.

Materiale și metode

Declarație de etică- Animalele erau furnizate de laboratoarele Janvier și aveau acces la hrană și apă ad libitum. Experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu și cu aprobarea comitetului local de etică (acord CEEA 062010R), a standardelor pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și a liniilor directoare ale Franței și Comunității Europene.

Cultură de celule

Cultura neuronală embrionară primară- Neuronii corticali embrionari primari ai șobolanilor (neuroni primari) au fost preparați din embrioni de șobolani Wistar în vârstă de 17-18 zile, după cum urmează. Creierul și meningele au fost îndepărtate. Cortexul a fost disecat și disociat mecanic în mediu de cultură prin triturare cu o pipetă Pasteur lustruită. Odată disociate și după numărarea trypanului albastru, celulele au fost placate în lăcuțe Ibidi μ-Bi (Biovalley) sau Lab-Tek cu lamele cu patru godeuri (Becton Dickinson) acoperite cu poli-D-lizină (0,5 mg/ml) și laminină (10 μg/ml). Pentru disociere, placare și întreținere, am utilizat mediu Neurobazal suplimentat cu 2% B27 și conținând 200 mM glutamină și 1% agent antibiotic-antimicotic (Invitrogen). Neuronii primari la 7 zile in vitro (DIV7) au fost infectați cu vectori lentivirali (VS) care codifică GFP/mCherry actină, tubulină sau Tau de tip sălbatic uman (hTau1N4R conținând o etichetă V5; V5-hTau1N4R).

Linii telefonice- Celulele CAD neuronale de șoarece (linia celulară neuronală catecolaminergică de șoarece, diferențiată cu Cath.a) au fost cultivate în Opti-MEM (Invitrogen) cu ser bovin fetal 10%, penicilină/streptomicină (1%) și L-glutamină (1%). Celulele neuronale CAD au fost placate peste noapte în poli-D-lizină (0,5 mg/mL) acoperite cu Ibidi μ-vase pentru imagistică în viu sau lamele Lab-Tek cu patru godeuri pentru imunocolorare. Celulele CAD neuronale au fost infectate cu LV-uri care codifică GFP-actină, mCherry-tubulină sau Tau de tip sălbatic uman (hTau1N4R conținând o etichetă V5; V5-hTau1N4R).

Vectorii virali- Procedurile de producere a vectorilor lentivirali (LV) și de control al titrurilor virale ale acestora și absența retrovirusurilor competente au fost descrise anterior [19]. Toate loturile virale au fost produse în zone adecvate, în conformitate cu protocoalele instituționale pentru organismele modificate genetic conform „Comitetului științific al Consiliului Superior al Biotehnologiilor” (numărul de identificare 1285).

Anticorpi- Ca parte a acestei lucrări, s-au folosit diverși anticorpi primari: tubulină anti-a acetilată de șoarece (Sigma; 1: 200 pentru imunocitochimie); anticorp policlonal de iepure la V5 (Merck Millipore; 1: 10.000 pentru imunocitochimie); anticorp policlonal de iepure împotriva părții C-terminale a Tau (C-ter, crescut intern; 1: 800 pentru imunocitochimie și 1: 10.000 pentru biochimie) [20]; anticorp policlonal de iepure M19G, care recunoaște partea N-terminală a Tau (N-ter, crescut intern; 1: 10.000 pentru biochimie) [21]; și policlonal de iepure crescut împotriva anti-miozinei umane 10, care detectează mioza 10 de la mai multe specii, inclusiv șoareci și șobolani (Sigma; 1: 200 pentru imunocitochimie). Acești anticorpi au fost vizualizați folosind anticorpi secundari apropiați cuplați la Alexa 488 sau 647 (Life Technologies; 1: 1000 pentru Alexa 488 și 1: 500 pentru Alexa 647).

Imunofluorescența- Celulele neuronale CAD și neuronii primari au fost spălate cu PBS preîncălzit, fixate cu 4% paraformaldehidă (PFA) timp de 20 minute la temperatura camerei, permeabilizate cu 0,2% Triton X-100 timp de 20 minute la temperatura camerei și blocate timp de 45 minute la cameră temperatura utilizând soluția de blocare (albumina serică bovină (BSA) 2% în PBS). Celulele au fost apoi incubate peste noapte la 4 ° C cu anticorp primar diluat în soluție de blocare înainte de a fi spălate cu atenție și incubate timp de 30 de minute la temperatura camerei cu anticorpul secundar adecvat conjugat cu fluor fluor. Celulele au fost spălate și montate cu VectaShield/4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Vector Laboratories) pentru a marca nucleele.

Colorare tubulin tracker pentru imagini live- Celulele CAD neuronale au fost placate peste noapte la 100.000 per 35 mm vas de cultură cu fund de sticlă (Biovalley, Franța), spălate cu PBS preîncălzit și incubate 30 min la 37 ° C cu tubulin Tracker verde (Life Technology; diluție 1: 1000 ) diluat în tampon HBSS și clătit de 3 ori cu PBS preîncălzit înainte de imagistică.

Purificarea Tau1N4R umană

Asamblare și etichetare Tau1N4R uman

Fibrilarea hTau1N4R a fost realizată la 40 μM în prezența heparinei 10 μM prin agitarea alicoturilor de soluție de 0,5 ml la 37 ° C într-un termomixer Eppendorf setat la 600 rpm timp de 4 zile. Fibrilele au fost rotite timp de 20 de minute la 20 ° C și 16.000 rpm. Cantitatea de material fibrilar a fost estimată prin scăderea fracției solubile rămase după centrifugare din concentrația inițială. Materialul peletat a fost resuspendat în PBS la o concentrație monomerică echivalentă de hTau1N4R de 100 μM.

Etichetarea fibrilelor hTau1N4R a fost realizată prin adăugarea a 2 echivalenți molari de ATTO 488, ATTO 568 sau ATTO 647 (Life Technologies # A20003) reactiv la lizină (1 Tehnologii de viață # A20003) timp de 1 oră la temperatura camerei. Fluoroforul nereacționat a fost îndepărtat prin două cicluri de centrifugare la 15.000 g timp de 10 minute și resuspendarea peletei în PBS.

Purificare și asamblare Sup35NM

Purificarea și asamblarea Sup35NM au fost efectuate așa cum este descris în Krzewska și colab. [22]. Etichetarea fibrilelor Sup35NM a fost efectuată identic cu cea a fibrilelor Tau.

Microscopie electronică

Natura ansamblurilor hTau1N4R și Sup35NM a fost evaluată folosind un microscop electronic cu transmisie JEOL 1400 după adsorbție pe rețele de 200 ochiuri acoperite cu carbon și colorare negativă cu 1% acetat de uranil. Imaginile au fost înregistrate cu o cameră CCD Gatan Orius (Gatan).

Activarea TNT-urilor- Pentru experimentele de activare TNT, celulele neuronale CAD și neuronii primari au fost incubate timp de 5 minute la 37 ° C cu fibrile hTau1N4R recombinate 1 μM marcate cu ATTO 647 sau nemarcate. S-au efectuat clătiri cu PBS preîncălzit (3 ×) înainte de imunocolorare sau imagistică în timp real.

Saturația anticorpilor- Înainte de incubare cu celule, anticorpii C-ter au fost incubați (24 h/4 ° C/agitație orbitală) cu soluție de blocare conținând fie concentrații saturate de fibrile hTau1N4R recombinate (100 ×), fie BSA (100 ×) ca martor. Celulele au fost imunomarcate așa cum s-a descris mai sus.

Captarea și transferul fibrilelor hTau1N4R- Celulele CAD neuronale au fost placate peste noapte la 60.000 de celule pe godeu în lamele de cameră cu patru godeuri Lab-Tek acoperite cu poli-D-lizină (Becton Dickinson). Celulele au fost infectate cu LV-uri care codifică mCherry-Actin. Fibrilele ATTO 488-hTau1N4R au fost diluate la 1 μM în 100 μL de OptiMEM (Gibco). Apoi, 96 pl de OptiMEM și 4 pl de Lipofectamină-2000 (Invitrogen) au fost adăugați la fibrilele ATTO 488-hTau1N4R la un volum final de 200 pl timp de 20 de minute înainte ca amestecul să fie adăugat la celule. Pentru neuronii primari, 50.000 de celule au fost placate în diapozitive cu patru godeuri Lab-Tek acoperite cu poli-D-lizină și laminină (Becton Dickinson). Celulele au fost infectate la DIV7 cu LV-uri care codifică mCherry-Actin. Fibrilele ATTO 488-hTau1N4R au fost diluate la 1 μM în 100 μL de mediu neurobazal (Gibco). Apoi, 96 μL de mediu neurobazal și 4 μL de lipofectamină-2000 (Invitrogen) au fost adăugați la fibrilele ATTO 488-hTau1N4R la un volum final de 200 μL timp de 20 de minute înainte ca amestecul să fie adăugat la celule. Șase ore mai târziu, celulele au fost clătite cu mediu pre-încălzit (3 ×) înainte de imunocolorare.

Pentru transferul de la neuron la neuron, celulele CAD sau neuronii primari (100.000 de celule/vas) au fost placate pe Ibidi μ-Dish și infectate cu LV care codifică GFP-Actin. Fibrilele ATTO 568-hTau1N4R au fost diluate la 1 μM și adăugate la celule. Șase ore mai târziu, celulele au fost spălate cu PBS pre-încălzit (3 ×) înainte de achiziție utilizând microscopie în timp real.

Electroforeză și imunoblotare- Celulele neuronale CAD au fost clătite o dată în PBS și lizate în tampon RIPA (150 mM NaCI, 1% NP40, 0,5% deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS și 50 mM Tris HCI; pH = 8,0). Controalele pozitive au fost omogenizate de celule hipocampice de șoareci de tip sălbatic (CTL1) sau celule CAD neuronale infectate cu LV care codifică hTau1N4R (CTL2). Concentrațiile de proteine ​​au fost determinate (PIERCE BCA Protein Assay Kit), iar probele au fost diluate la 1 μg/μL în LDS conținând 50 mM DTT. Apoi, 15 μg de proteine ​​au fost denaturate la 100 ° C timp de 10 minute, încărcate pe 4-12% NuPAGE geluri Novex (Invitrogen) și transferate în membranele de nitroceluloză. Membranele au fost blocate în soluție salină tamponată cu Tris, pH 8,0, 0,05% Tween 20 cu 5% lapte degresat sau 5% BSA și incubate cu primarul corespunzător peste noapte la 4 ° C. Membranele au fost apoi clătite și incubate în continuare cu anticorp secundar marcat cu peroxidază de hrean (IgG anti-iepure de capră, Sigma), iar benzile au fost vizualizate prin chemiluminiscență (ECL, Amersham Biosciences) cu un sistem de imagistică LAS3000 (Fujifilm).

analize statistice- Datele sunt prezentate ca mijloace (± SEM) ale experimentelor efectuate cel puțin în triplu exemplar și sunt reprezentative pentru rezultatele obținute din trei experimente independente care au produs rezultate similare. Analizele statistice au fost efectuate folosind Mann-Whitney U-Test (software prism GraphPad) pentru a determina p-valoare. Diferențele au fost considerate semnificative la * p

Rezultate

Tau este prezent în TNT în celulele CAD în condiții bazale

Film pentru mecanismul de formare „asemănător filopodiei” în celulele CAD neuronale. (MOV 3265 kb)