Marc-Etienne Huot

1 Centrul de cercetare a cancerului la Universitatea Laval; Hotel-Dieu de Quebec; CHUQ; Quebec City, QC, Canada

Stéphane Richard

2 Terry Fox Molecular Oncology Group și Bloomfield Center for Research on Aging; Lady Davis Institute for Medical Research și Departamentele de Oncologie și Medicină; Universitatea McGill; Montreal, QC, Canada

Abstract

Splicarea alternativă este bine cunoscută ca fiind specifică țesutului. Deși s-a demonstrat că mai multe gene suferă splicing alternativ în adipocite, se știe puțin despre mecanismul care reglează splicing alternativ în timpul adipogenezei. Am raportat recent că șoarecii Sam68 -/- prezintă un fenotip slab și sunt protejați împotriva obezității induse de dietă. Analiza noastră de genon la nivel de matrice de exoni în țesutul adipos alb (WAT) de la șoareci de tip sălbatic și Sam68 -/- a relevat că deficiența Sam68 duce la o îmbinare anormală a genei mTOR. Acest lucru s-a dovedit a reduce conținutul total de proteine ​​mTOR și activitatea în timpul diferențierii in vitro adipoase. La șoareci Sam68 -/-, această situație duce la o creștere a cheltuielilor de energie, scăderea adipogenezei și formarea WAT.

Introducere

Disponibilitatea șoarecilor cu deficit de Sam68 a condus la identificarea unora dintre rolurile fiziologice ale acestei proteine ​​de legare a ARN de tip KH. Șoarecii Sam68 -/- nu prezintă niciun fenotip evident, dar șoarecii masculi sunt infertili din cauza unui defect de spermatogeneză, în timp ce femelele au fertilitate redusă datorită defectelor în expresia corectă a transcrierilor receptorului gonadotropinei în foliculii pre-ovulatori din ovarul adult. 15 - 18 Mai mult, șoarecii Sam68 -/- sunt protejați împotriva osteoporozei induse de vârstă. 16 Într-adevăr, șoarecii Sam68 -/- în vârstă s-au dovedit a păstra densitatea osoasă prin promovarea diferențierii osteoblaste dependente de Sam68 și sunt astfel protejați împotriva pierderii osoase legate de vârstă. 16 Aceste rezultate sugerează că Sam68 este direct implicat în diferențierea celulelor stem mezenchimale. Pierderea expresiei Sam68 mută diferențierea celulelor stem mezenchimale către linia osteogenică, în locul liniei adipocitice. Acest lucru a fost confirmat de demonstrația noastră recentă că șoarecii cu deficit de Sam68 sunt slabi și protejați împotriva obezității induse de dietă. 5

Sam68 și Adipogeneza

mTOR Splicing

Folosind o matrice de expresie a exonului la nivelul întregului genom, am constatat că pierderea Sam68 influențează îmbinarea unui număr mare de gene în țesutul adipos alb. Am arătat că îmbinarea genei mTOR este foarte influențată de nivelurile Sam68. mTOR aparține familiei de proteine ​​legate de fosfatidilinozitol 3-kinază și se știe că reglează procesele celulare cheie, cum ar fi mărimea celulei, proliferarea celulelor, motilitatea celulelor și supraviețuirea celulelor. 19 mTOR este subunitatea catalitică găsită în două complexe diferite (mTORC1 și mTORC2). 20 mTORC1 se caracterizează prin asocierea sa cu proteina Raptor și sensibilitatea sa la rapamicină, în timp ce mTORC2 se caracterizează prin prezența proteinei Rictor și rezistența sa la rapamicină. 19 Se știe că inhibarea mTORC1 previne diferențierea adipogenă a pre-adipocitelor 21, 22 și reglează în jos depunerea de grăsime la rozătoare. 23, 24 Mai mult, inhibarea semnalizării mTORC1 la șoareci duce la fenotipuri slabe. 25 - 27

Din motivele menționate mai sus, am decis să investigăm mai în detaliu îmbinarea alternativă dependentă de Sam68 a mTOR. 5 Am constatat că pierderea Sam68 activează utilizarea unui semnal intronic de poliadenilare în cadrul intronului 5 al genei mTOR. Această nouă izoformă pe care o desemnăm ca mTORi5, include exoni de la 1 la 5 plus o readtrare a intronului 5, generând astfel un

ARNm de 1 kb (Fig. 1A). Am arătat că Sam68 se asociază cu două secvențe UUUUA scurte în cadrul intronului 5. Mutațiile din fiecare dintre cele două elemente UUUUA ale secvențelor influențează legarea Sam68 și conduc la o creștere a nivelului de proteină mTORi5 izoformă.

rămâneți

figura 1. Reprezentarea schematică a funcției Sam68 în timpul adipogenezei. (A) Efectul Sam68 asupra îmbinării ARNm mTOR. Inactivarea Sam68 sau afectarea legării sale la elementele specifice prezente în intronul 5 mTOR crește read-through și includerea intronului 5, activând astfel un semnal de poliadenilare intronic. Acest lucru duce la o nouă variantă a mRNA mTOR a cărei traducere prezice sinteza unei versiuni trunchiate a mTOR, denumită mTORi5. (B) Inactivarea Sam68 blochează progresia adipogenezei la nivel de preadipocite, datorită unei scăderi a cantității de proteine ​​mTOR pe toată lungimea, ceea ce duce la lipsa activării mTORC1/2.

mTORi5

Folosind qRT-PCR, am observat că mRNA mTORi5 este abundent în celulele 3T3-L1 cu deficit de Sam68, dar absente în celulele 3T3-L1 de control. Deoarece intronul mTOR 5 adăpostește un codon de terminare prematură în cadru, precum și un semnal de poliadenilare, se așteaptă ca evenimentul de retenție a intronului să conducă la o proteină mTOR de

25 kDa cu o trunchiere C-terminală mare. Proteina prognozată a fi exprimată din ARNm mTORi5 ar conține majoritatea domeniilor de căldură N-terminale, un tip de domeniu de interacțiune proteină-proteină găsit într-un număr de proteine ​​citoplasmatice. Acest lucru ne-a determinat să credem că proteina mTORi5 ar putea prezenta un comportament dominant-negativ prin legarea sa la o componentă a complexelor mTORC1/2, formând astfel un complex inactiv catalitic. Pentru a evalua această posibilitate, am introdus un vector care exprimă o proteină mTORi5 marcată cu FLAG în celulele HeLa. Am monitorizat apoi activitatea complexelor mTORC1/2, folosind anticorpi ribosomali proteici fosfo-specifici S6 (pentru a detecta activitatea mTORC1) și anticorpi AKT fosfo-specifici (pentru a evalua activitatea mTORC2). desi

Proteina FLAG-mTORi5 de 25 kDa a fost exprimată efectiv în aceste celule, am constatat că nu a avut practic nicio influență asupra nivelurilor de fosforilare a proteinei ribozomale S6 S240/S244 sau AKT S473 după stimularea insulinei. Mai mult decât atât, nu am reușit să detectăm proteina mTORi5 în celule în care expresia Sam68 a fost abrogată folosind anticorpi comerciali specifici N-terminali care au recunoscut expresia ectopică a FLAG-mTORi5. Aceste rezultate ne-au permis să excludem orice funcție dominant-negativă pentru proteina mTORi5 și a sugerat că mRNA sau proteina mTORi5 ar putea fi degradată rapid printr-un mecanism încă neidentificat.

Sam68 Reglează activitatea mTOR

Un efect major al generării izoformei mTORi5 este scăderea nivelului de mARN și proteine ​​mTOR. Deoarece mTORC1 este esențial pentru adipogeneza normală și ca epuizare a componentei majore a complexului, și anume mTOR, afectează diferențierea pre-adipocite, o deficiență a expresiei Sam68 duce la o scădere a activității mTORC1. Efectul general al activității mTORC1 reduse este o inhibare a diferențierii pre-adipocite (Fig. 1B). Interesant este că am reușit să golim în prealabil ultimul fenotip reintroducând mTOR de lungime completă în celulele 3T3-L1 cu deficit de Sam68. Ultimul rezultat indică faptul că Sam68 contribuie la adipogeneză asigurând îmbinarea corectă a intronului 5 în cursul sintezei mRNA mTOR, permițând astfel exprimarea mTOR de lungime completă.

Concluzie

Munca noastră sugerează că Sam68 este un regulator cheie al îmbinării alternative în țesutul adipos alb. Rezultatele noastre oferă noi oportunități terapeutice pentru blocarea adipogenezei și obezității induse de dietă, care ar putea preveni complicațiile pe termen lung legate de obezitatea indusă de dietă, una dintre principalele cauze de deces prevenibile în America de Nord.