Neuroștiința autonomă

Acest articol face parte din subiectul de cercetare

Abordări terapeutice neuroprotetice pentru bolile imune, neuronale și vasculare: aspecte teoretice, experimentale și clinice. Vizualizați toate cele 6 articole

Editat de
MICHELE PAPA

Universitatea din Campania Luigi Vanvitelli, Italia

Revizuite de
Bruno Bonaz

Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble, Franța

Miriam O. Ribeiro

Universitatea Presbiteriană Mackenzie, Hotel Brazilia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

conversației

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Laborator cheie de cercetare în acupunctură și medicină al Ministerului Educației, Universitatea de Medicină Chineză din Nanjing, Nanjing, China
  • 2 Spitalul afiliat al Universității de Medicină Chineză din Nanjing, Nanjing, China

Introducere

În studiul de față, am confirmat efectul terapeutic al EA la șobolani cu obezitate indusă de dietă bogată în grăsimi (HFD) și am explorat potențialele mecanisme neuro-imune care stau la baza acestui efect examinând expresia SNS, iWAT, SAMs, NE, receptorul adrenergic β3, UCP1 și Slc6a2 la șobolanii obezi care sunt tratați cu EA.

Materiale și metode

Animale

Animalele de experiment au fost 65 șobolani Sprague-Dawley masculi înțărcați (3 săptămâni) (Model Animal Research Center din Nanjing Medical University, China) care au fost împărțiți într-un grup de dietă normală (grupul de control), un grup HFD și un HFD cu EA grup. Șobolanii au fost adăpostiți în condiții de mediu controlate (temperatură: 22 ° C, umiditate relativă: 40-60% și 12/12 h ciclu lumină/întuneric) și li s-a oferit acces gratuit la apă și alimente. Grupul HFD + EA și grupul HFD au fost hrăniți cu o dietă care conținea 45 kcal% grăsimi (Research Diets, D12451), oferind 473 kcal/100 g, iar grupul normal a fost hrănit cu o dietă obișnuită de șobolan, oferind 352 kacl/100g. După hrănire timp de 11 săptămâni, intervenția EA a fost efectuată pe grupul HFD + EA. Durata intervenției EA a fost de 4 săptămâni. Greutatea corporală a animalelor a fost măsurată în fiecare săptămână. Înainte de sacrificiu, trei șobolani din grupul HFD au fost injectați cu antagonistul receptorului beta Propranolol în iWAT. Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu Principiile de îngrijire a animalelor de laborator și Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator publicat de National Science Council, China.

Stimularea EA

ST25 (Tianshu) este situat la 5 mm lateral până la intersecția dintre 2/3 superioare și 1/3 inferioare (Yu și colab., 2013), în linia care unește procesul xifoid și marginea superioară a simfizei pubiene. Regiunea ST25 este utilizată pe scară largă în studiile clinice (Chen și colab., 2018). Ace au fost conectate la instrumentul EA al lui Han (LH402A; Beijing Huawei Technologies Co. Ltd). Stimularea curentă a fost de 2 mA; frecvență alternativă, 2/15 Hz; timp de stimulare, 20 min. Procedura a fost efectuată de 6 ori pe săptămână și a durat 4 săptămâni. În experimentul de electrofiziologie, stimularea EA a durat 60 de secunde.

Măsurători de electrofiziologie

Șobolanii din grupul de dietă normală și grupul HFD au fost anesteziați cu izofluran (RWD Life Science, China) și s-a făcut o incizie inghinală. Apoi, nervii prezenți în iWAT au fost separați și conectați la electrozi de platină cu gheare duble. Rata de tragere a fost înregistrată utilizând un preamplificator (NL100; CED, Regatul Unit) și un modul bioelectric Micro1401-3 (NL125NL126; CED, Regatul Unit) conectat la un sistem de achiziție și analiză biosemnal (Microl 1401-3; CED, Regatul Unit). Filtrarea semnalului a fost setată la 10–1000 Hz; frecvența de eșantionare a fost de 20000 Hz și amplificarea de 1000 de ori. Datele au fost înregistrate peste 180 s de fiecare dată cu software-ul Spike2: înainte de EA, 60 s; în timpul EA, 60 s; după EA, 60 s.

ELISA

Soluția standard sau eșantion (100 μL) a fost adăugată la microplăcile de polistiren cu 96 de godeuri și incubată la 37 ° C timp de 90 de minute. Apoi, 10 pl de anticorpi biotinilați (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing) au fost adăugați la godeuri și incubați la 37 ° C timp de 60 de minute. Soluția din fiecare godeu a fost apoi aspirată și fiecare godeu a fost spălat de trei ori cu 350 μL de 1 × tampon de spălare. Apoi, s-au adăugat 100 pl de substrat de tetrametilbenzidină (TMB) la fiecare godeu și s-au incubat timp de 10 min. Pentru a opri reacția, s-au adăugat 100 μl de soluție stop și godeurile au fost citite la 450 nm.

Analiza Western Blot

Țesutul adipos alb inghinal a fost recoltat folosind kitul de extracție a proteinelor adipoase (MinuteTM) pentru extracția proteinelor. 80 μg de țesut adipos au fost omogenizate cu 300 μl tampon de extracție. După centrifugare la 2.000 rpm timp de 1 min, țesutul a fost transferat într-un cartuș filtrant cu un tub de colectare și incubat la -20 ° C timp de 15-20 min. După incubare, a fost imediat centrifugată la 2000 rpm timp de 1-2 minute cu capacul deschis. Fluxul conținea proteine ​​totale din țesutul adipos. Apoi, 20 μg de lizat tisular total au fost separate prin SDS-PAGE (10% gel de separare și 5% gel concentrat). Electroforeza conținea 80 V timp de 0,5 h și 120 V timp de 1 oră. Benzile proteice au fost transferate într-o membrană PVDF utilizând Trans-Blot (Bio-Rad) și s-a adăugat 5% BSA timp de 2 ore pentru a bloca membrana. Membrana a reacționat apoi cu anticorpi primari împotriva: UCP1 (1: 1000, Abcam), transportor de norepinefrină (1: 1000, Abcam), β-actină (1: 1000, Abcam), receptor adrenergic β3 (1: 1000, Abcam), și tirozin hidroxilază (1: 1000, Abcam) sub 4 ° C peste noapte. Incubația cu anticorpii secundari corespunzători (diluați la 1: 3000, Abcam) a fost efectuată la temperatura camerei timp de 1 oră.

Immunostaining pe întreg muntele

Procedura s-a bazat pe protocolul Xin (Li și colab., 2019). Probele iWAT au fost scufundate într-o soluție de fixare (1% PFA în 1 × PBS, pH 7,4) la 4 ° C timp de 24-48 ore. Probele au fost tăiate în cuburi de 2 mm 3 și fixate cu 1 × PBS-TX. Au fost apoi blocați cu tampon de blocare Sea Block (Thermo Fisher Scientific, Statele Unite) timp de 2 ore și incubați cu anticorpi primari împotriva următoarelor proteine ​​la 4 ° C peste noapte: TH (1: 200, Abcam), F4/80: 200, Santa Cruz) și transportorul NE Slc6a2 (1: 200, Abcam). Au fost apoi incubate cu anticorpii secundari corespunzători (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594 și, respectiv, Alexa Fluor 647; Abcam) la o diluție de 1: 200 la RT timp de 2 ore. Pentru clearance-ul optic, s-a utilizat glicerol 90%, iar probele au fost menținute la 4 ° C în întuneric până când au devenit transparente. Imaginile au fost capturate cu un microscop confocal cu scanare laser.

RT-PCR

ARN total a fost extras din 200 mg de iWAT folosind Trizol (TaKaRa, Japonia). ARN-ul total a fost transcris invers pentru a produce ADNc de către un ciclotermic (Bio-Rad, Statele Unite) cu PrimeScript RT Master Mix (TaKaRa, Japonia) la 37 ° C timp de 15 minute și 98 ° C timp de 15 secunde. Amestecul de reacție PCR (20 μL) conținea 4 μL de primer direct, 4 μL de primer invers, 2 μL de ADNc și 10 μL de SYBR Green Mix (TaKaRa, Japonia). Protocolul PCR a fost după cum urmează: 40 de cicluri de amplificare timp de 30 s la 95 ° C, 5 s la 95 ° C și 30 s la 60 ° C. Datele au fost prelucrate folosind metoda 2 –ΔΔCT. Grundele utilizate în experiment sunt prezentate în Tabelul 1.

tabelul 1. Secvențe ale primerilor utilizați pentru PCR în timp real.

Analize statistice

Datele au fost analizate folosind Prism 6.0. Toate datele sunt prezentate ca medie ± SE. Grupurile au fost comparate folosind analiza unică a varianței (ANOVA) urmată de post hoc Testele studențești Newman-Keuls. P 0,05). (C) Nivelul relativ al proteinelor din TH (în grupurile martor, HFD și HFD + EA)n = 3, P > 0,05). (D) Forma de undă reprezentând descărcare spontană în eWAT în timpul EA în grupul de control și HFD. (E) Modificarea procentuală a ratei de tragere a eWAT în timpul EA în grupul de control și HFD (n = 6, **P Cuvinte cheie: obezitate, electroacupunctură, țesut adipos alb inghinal, sistem nervos simpatic, macrofag asociat simpatic

Citație: Lu M, He Y, Gong M, Li Q, Tang Q, Wang X, Wang Y, Yuan M, Yu Z și Xu B (2020) Rolul conversației încrucișate neuro-imune în efectul anti-obezitate al electro -Acupunctura. Față. Neuroști. 14: 151. doi: 10.3389/fnins.2020.00151

Primit: 21 noiembrie 2019; Acceptat: 10 februarie 2020;
Publicat: 28 februarie 2020.

Michele Papa, Universitatea din Campania Luigi Vanvitelli, Italia

Miriam Oliveira Ribeiro, Universitatea Presbiteriană Mackenzie, Brazilia
Bruno Bonaz, Centre Hospitalier Universitaire de Grenoble, Franța